猪细小病毒VP2蛋白重组杆状病毒的构建表达与鉴定_丁国伟.pdf

52|2023 年第 43 卷第1期 总第300期|禽 业 篇猪细小病毒 VP2 蛋白重组杆状病毒的猪细小病毒 VP2 蛋白重组杆状病毒的构建表达与鉴定构建表达与鉴定丁国伟，李甜甜，徐 萍，潘 晨，王设市，魏荣荣，荣雪路，范 娟丁国伟，李甜甜，徐 萍，潘 晨，王设市，魏荣荣，荣雪路，范 娟*(扬州优邦生物药品有限公司，江苏 扬州 225008)(扬州优邦生物药品有限公司，江苏 扬州 225008)猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)能导致初产母猪及血清学阴性的经产母猪发生流产、不孕以及产死胎、木乃伊胎和弱仔等1。断奶仔猪多系统衰竭综合征(porcine post weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要发病原因是仔猪混合感染 PPV 与猪圆环病毒 2 型所致2-3。PPV 具有极强的感染性和传播性，一旦猪群中的某一头猪感染 PPV，猪群中其他猪在 3 个月内都可能会感染。另外，PPV 难以被清除，尤其是在该病毒流行的猪场，由其引发的母猪繁殖障碍能持续几年甚至十几年之久4。PPV 在环境中具有极强的存活能力，对 pH 和温度不敏感。除了对养猪企业的危害外，PPV 也会严重危害生产猪细小病毒病疫苗的企业，在疫苗生产过程中一旦出现散毒或消杀不彻底的情况，将会极大影响后续生产。PPV 属于细小病毒科细小病毒属，无囊膜，病毒粒子呈二十面体对称，直径介于 20 25 nm。PPV 的基因组为单股负链 DNA，5 000 bp 左右，负链上没有开放阅读框(open reading frame，ORF)，正链有 2 个 ORF。5端编码三种非结构蛋白 NS1、NS2 和 NS3，其中 NS1 蛋白与基因复制有关，其他两个非结构蛋白的功能尚不清楚5-7。3端编码三种结构蛋白 VP1、VP2、VP3，其中 VP3 蛋白由 VP2蛋白水解产生，VP1 蛋白与病毒复制有关，VP2 蛋白在整个病毒衣壳中占据主要地位，拥有 4 个 Loop 环，抗原位点主要集中在这几个环上，位于蛋白表面。PPV 很多重要的线性表位在 VP2 蛋白上，病毒能够利用 VP2 蛋白自我组装成没有核酸、不能自我复制的病毒样颗粒中图分类号：S855 文献标志码：A 文章编号：1001-0769(2023)01-0052-06摘 要：为构建一种能够用于开发猪细小病毒病毒样颗粒疫苗的猪细小病毒 VP2 蛋白的重组杆状病毒。根据 GeneBank 数据库中的猪细小病毒全基因组序列设计并合成了对能扩增VP2基因的引物，采用 PCR 扩增猪细小病毒 BJ-2 株的VP2基因，并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBacH TA 中，获得阳性质粒 pFastBac-PPV VP2；测序后将该质粒转化到大肠杆菌 DH10Bac感受态细胞中，获得含有VP2基因的重组杆状病毒质粒 Bacmid-PPV VP2；最后将获得的重组杆状病毒质粒 Bacmid-PPV VP2 转染 Sf9 昆虫细胞，并成功拯救了能稳定表达猪细小病毒 VP2 蛋白的重组杆状病毒 Bacmid-PPV VP2。结果发现，该重组病毒可用于稳定表达猪细小病毒 VP2 蛋白，并且表达的 VP2 蛋白可在体外自我组装形成病毒样颗粒，电镜观测其颗粒大小与猪细小病毒全病毒大小类似，且形成的病毒样颗粒与全病毒一样具有豚鼠红细胞凝集作用，凝集效价可达12 048。故构建的表达猪细小病毒 VP2 蛋白的重组杆状病毒为研制猪细小病毒的基因工程亚单位疫苗奠定了基础。关键词：猪细小病毒；VP2基因；重组杆状病毒；病毒样颗粒基金项目：扬州市科技计划项目(项目编号：YZ2021098)作者简介：丁国伟(1989 )，男，硕士，主要从事畜禽用基因工程疫苗开发研究；E-mail：*通信作者：范娟，博士；E-mail：试验研究猪 业 篇|2023年第43卷第1期 总第300 期|53 禽 业 篇猪 业 篇试验研究(virus like particles，VLPs)8，同时诱导猪产生体液免疫和细胞免疫9。目前，预防猪细小病毒病主要采用接种疫苗进行干预，市场上主要使用的猪细小病毒病疫苗为灭活疫苗。该疫苗虽然能够有效控制 PPV 的临床感染，但对疫苗生产企业而言，存在生物安全风险10。所以，研制安全、新型的猪细小病毒病疫苗对控制和彻底消灭此病具有重要意义11。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达 VP2 蛋白，利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay，IFA)、透 射 电 镜(transmission electron micrograph，TEM)、豚鼠红细胞凝集试验等方法观察和分析 VP2 蛋白的表达情况，为后续研究猪细小病毒的病毒样颗粒疫苗奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 毒株、菌种和细胞PPV BJ-2 株由扬州优邦生物制药有限公司保存；Sf9 昆虫细胞、大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞、pFastBac 均购自Invitrogen公司。1.1.2 主要试剂 EasyTaq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、T4连接酶、DNA 凝胶纯化试剂盒、ProteinFind Anti-His 单 克 隆 抗 体 和 异 硫 氰 酸 荧 光 素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的羊抗鼠 IgG 均购自北京全式金公司；质粒抽提试剂盒购自 Axygen 公司；昆虫细胞培养基(Grace)和转染试剂 Cellfectin 购 自 Invitrogen 公 司；抗 PPV 阳 性 血 清 购自国生生物；FITC 标记的山羊抗猪 IgG 购自Southern Biotechnology 公司；其他常规试剂均为国产。1.2 方法1.2.1 引物设计与合成设计并合成一对扩增 PPV VP2基因的引物，引物序列为：VP2-F：5-CGCCGCGGATCCATGTCTGAGAACGTGGAAC-3，VP2-R：5-CCCCCCAAGCTTTTAGTACAGC TTTCTAGGG-3。其中加粗碱基为保护性碱基，上、下游引物的斜体碱基分别为BamH 和Hind 酶切位点。合成 M13 通用引物，引物序列为：M13-F：5-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，M13-R：5-CAGGAAACAGCTATGACC-3。1.2.2 PPV VP2基因的扩增及杆状病毒转移载体的构建 以 提 取 的 PPV 基 因 组 DNA 为 模 板 扩 增VP2基 因。将 纯 化 的 PCR 产 物 和 转 移 载 体pFastBac 经BamH 和Hind 双酶切后分别回收目的片段并连接，构建重组杆状病毒转移载体pFastBac-PPV VP2，转化后提取质粒，取经 PCR 鉴定为阳性的质粒送南京金斯瑞生物技术公司测序。1.2.3 重组杆状病毒质粒 Bacmid-PPV VP2 的构建及鉴定将重组杆状病毒转移载体 pFastBac-PPV VP2 转化至大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞中，并涂于含有卡那霉素(Kan+)、庆大霉索(G+)、四环素(T+)、X-Gal 和异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactoside，IPTG)的 卢 里 亚-贝 尔 塔 尼(Luria-Bertani，LB)培养基筛选平板上，37 下培养 24 48 h，挑取白色菌落并进行 2 次纯化，根据 Bac to Bac 表达系统说明书，提取含有VP2基因的重组杆状病毒质粒 Bacmid-PPV VP2，同时转化 pFastBac 作为阴性对照，并提取仅含有His 标签的重组质粒 Bacmid-HTA，用 M13 通54|2023 年第 43 卷第1期 总第300期|禽 业 篇用引物进行 PCR 鉴定。1.2.4 转染、收获重组杆状病毒根据 Cellfectin 说明书将重组杆状病毒质粒 Bacmid-PPV VP2 转染入 Sf9 昆虫细胞。转染后置于 27 培养箱中继续培养 72 h以上，直至细胞出现明显病变为止，收集细胞上清，即为 P1 代重组杆状病毒。P1 代病毒在Sf9 昆虫细胞上经 2 次传代扩增后，即为 P3代重组杆状病毒。1.2.5 间接免疫荧光检测 VP2 蛋白的表达以 P3 代重组杆状病毒感染对数生长期的Sf9 昆虫细胞，同时以野生型杆状病毒感染的Sf9 昆虫细胞作为阴性对照，以未接种病毒的正常 Sf9 昆虫细胞作为空白对照，27 下培养 48 h 以上，待接种病毒的细胞发生较明显的病变时收集上清，保留细胞，用间接免疫荧光试验分别对 VP2 蛋白和 His 标签进行检测。对VP2 蛋白表达的检测：细胞用 20 预冷的丙酮-乙醇(体积比 4 1)混合液 4 下固定 30 min；PBS 清洗 3 次，甩干后加入按 1 1 000 稀释的抗 VP2 阳性血清，37 下孵育 1 h；PBS 清洗 3 次，甩干后加入按 1 200稀释的 FITC 标记的山羊抗猪 IgG，37 下孵育 1 h；PBS 洗次后于荧光显微镜下观察。对 His 标签表达的检测：细胞用 20 预冷的丙酮-乙醇(体积比 4 1)混合液 4 下固定 30 min；PBS 清洗 3 次，甩干后加入按1 200 稀释的 ProteinFind Anti-His 单克隆抗体；37 下孵育 1 h；PBS 清洗次，甩干后加入按 1 200 稀释的 FITC 标记的羊抗鼠 IgG，37 下孵育 1 h；PBS 洗 3 次后于荧光显微镜下观察。1.2.6 VLPs 纯化及鉴定使用分子筛进行病毒样颗粒纯化，并收集纯化样本，经磷钨酸负染色处理，使用透射电镜观察病毒样颗粒的组装情况。2 结果与分析2.1 PPV VP2基因扩增与克隆 PCR 扩增获得 1 条 1 740 bp 的 DNA 产物(图 1)，与预期扩增片段大小一致。由图 2 可知，用 pFastBac F/R 通用引物对重组转移载体进行鉴定，结果获得 1 740 bp 的目的条带，阳性克隆测序结果表明成功构建重组杆状病毒转移载体 pFastBac-PPV VP2。试验研究猪 业 篇|2023年第43卷第1期 总第300 期|55 禽 业 篇试验研究猪 业 篇2.2 重组杆状病毒质粒 Bacmid-PPV VP2 的鉴定将重组杆状病毒转移载体 pFastBac-PPV VP2 及空载体 pFastBacH TA 分别转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞，并通过蓝白斑筛选 3次后提取质粒，经 M13 通用引物进行 PCR 鉴定，结果见图 3。由图 3 可知，pFastBac-PPV VP2 转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞后提取的质粒利用M13 通用引物可以扩增出 4 000 bp 左右的条带，而 pFastBacH TA 转化大肠杆菌 DH10Bac感受态细胞提取的质粒仅能扩增出 2 300 bp左右的条带，从而证明了重组杆状病毒质粒Bacmid-PPV VP2 构建成功。2.3 转染和 VP2 蛋白表达检测 将重组杆状病毒质粒 Bacmid-PPV VP2 按转染试剂盒说明书转染 Sf9 昆虫细胞，同时设立阴性对照孔。转染 72 h 后，转染重组杆状病毒质粒 Bacmid-PPV VP2 的 Sf9 昆虫细胞开始变大、变圆、空泡化，结果表明已成功拯救表达 VP2 蛋白的重组杆状病毒 rBac-PPV VP2。将成功拯救的重组杆状病毒 rBac-PPV VP2 在 Sf9 昆虫细胞上传至第 3 代，然后检测目的蛋白的表达情况。分别利用抗 PPV 阳性血清和 ProteinFind Anti-His 单克隆抗体作为一抗，然后利用相应的荧光二抗进行检测，结果见图 4。由图 4 可知，rBac-PPV VP2 接种 Sf9 昆虫细胞后荧光检测结果均为阳性，而野生型杆状病毒感染的 Sf9 昆虫细胞及未接种病毒的正常 Sf9 昆虫细胞均未出现荧光，表