猪源唾液酸黏附素受体的表达及其纳米抗体筛选_洪伟鸣.pdf

25黄强，文超良，孙从佼，等 鸡肠道微生物组成及其影响因素J 中国家禽，2021，43(8):96 105 26王晶，戴东，武书庚，等 鸡肠道微生物演替与早期定植的研究进展J 生物技术通报，2020，36(2):1 8 27黄永平，魏学强，马煜辉，等 乳杆菌属在抗细菌生物膜相关感染中的研究进展 J 重庆医学，2020，49(10):1697 1701 28李仲兴，王秀华，赵建宏，等 用 MH 琼脂进行五味子、白芍对252 株临床菌株的体外抗菌效果观察J 中医药研究，2000(4):44 46 29 马廉兰，李娟，刘志春，等 五味子等中草药对肠道致病菌和条件致病菌的抗菌作用J 赣南医学院学报，2003，23(3):241 244 30 袁昌衡，周启贵，杨飞，等 80 种中药水煎液对淋球菌的抑制试验 J 中国医院药学杂志，1997，17(11):508 509 31 李平兰，时向东，吕燕妮，等 常见中草药对两种肠道有益菌体外生长的影响 J 中国农业大学学报，2003，8(5):33 36洪伟鸣，郭子杰，李睿婷，等 猪源唾液酸黏附素受体的表达及其纳米抗体筛选 J 江苏农业科学，2023，51(4):186 190doi:10 15889/j issn1002 1302 2023 04027猪源唾液酸黏附素受体的表达及其纳米抗体筛选猪源唾液酸黏附素受体的表达及其纳米抗体筛选洪伟鸣，郭子杰，李睿婷，李玲，徐海，张亮，宋亮(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300)摘要:为制备特异性结合猪源 Sn 受体的纳米抗体分子，采用人工合成猪肺泡巨噬细胞 Sn 受体胞外区(Sn4D)基因序列，将其克隆至 pET 30a 载体中，并在大肠杆菌中诱导表达 Sn4D 蛋白;经 Ni 柱纯化的 Sn4D 蛋白作为靶标分子，在 T7 噬菌体展示的纳米抗体文库中进行 3 轮亲和筛选;然后从筛选产物中挑选单抗克隆噬菌体进行亲和力、特异性鉴定。结果显示，成功构建了 pET 30a Sn4D 重组表达载体，并诱导表达出约50 ku 的目标蛋白，Western blot 显示该蛋白具有良好的反应活性;经过 3 轮亲和筛选，投入产出比逐渐升高，并从筛选产物中鉴定出 6 株特异性结合 Sn4D的纳米抗体分子。该纳米抗体分子的获得为今后进一步开展抗病毒活性的研究奠定了良好基础。关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;Sn 受体;纳米抗体;亲和筛选中图分类号:S852 4文献标志码:A文章编号:1002 1302(2023)04 0186 05收稿日期:2022 05 07基金项目:江苏省高等学校大学生创新创业训练 计 划(编号:202112806010Y)。作者简介:洪伟鸣(1981)，男，江苏泰州人，硕士，副教授，主要从事兽用生物药物研发，E mail:jsahvc 163 com;共同第一作者:郭子杰(2002)，男，江苏扬州人，畜牧兽医专业在校生。通信作者:洪伟鸣，E mail:jsahvc163 com。病毒受体是指在宿主细胞内部或者细胞膜表面可特异性地与病毒结合，并促使病毒感染的糖类、脂类以及蛋白质类分子单体或复合物，其主要功能是识别细胞内外的病毒粒子并与之结合1。当前研究较为深入的病毒受体已达 30 多种，其中，唾液酸黏附素(Sialoadhesin，Sn)，又被称为 Siglec 1 或者 CD169，是一种巨噬细胞限制的型跨膜糖蛋白，属于唾液酸凝集素受体家族2 3。猪源 Sn 是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)入侵宿主的特异性细胞受体之一4，PRRSV 与 Sn 受体的结合增强了病毒向细胞表面的聚集，然后由网格蛋白介导内吞作用进入细胞5。由于 Sn 受体在 PRRSV 感染宿主过程中发挥着重要作用，使其成为了抗 PRRSV药物研究的重要靶点。早期研究表明，利用完整的靶细胞或者靶细胞膜免疫小鼠可筛选出能够阻断病毒结合的抗体。在研究 PRRSV 与巨噬细胞互作的过程中，发现 2 个肺泡 巨 噬 细 胞 特 异 性 单 克 隆 抗 体(mAb41D3、mAb41D5)能够阻断 PRRSV 的感染6。因此，分离纯化细胞表面的病毒受体分子，再制备针对受体的单克隆抗体，通过特异性单克隆抗体竞争性阻断病毒与受体的结合，是开发抗病毒药物的重要策略之一7。由于病毒受体分子在细胞表面丰度较低，其占比不足细胞膜总蛋白的万分之一，并且多为整合蛋白的形式包埋于脂质双层膜中，因此直接分离纯化受体分子的可操作性不强8。以猪源 Sn 受体为例，其完整的分子结构包含 17 个结构域，又可分为胞外区、跨膜区和胞内区 3 个部分，其中胞外区具有免疫球蛋白样结构的区域是病毒结合位点9。利用基因工程方法表达 Sn 受体胞外区蛋白分子，用于制备特异性抗体是值得尝试的途径。681江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期纳米抗体是一种新型的基因工程抗体，因其天然缺失轻链，分子大小为纳米级，故被称为纳米抗体10。相比传统抗体而言，纳米抗体因其分子量小、稳定性强、亲和力高、组织穿透力强、易于生产和制备等诸多优势，在疾病诊断、治疗和预防领域得到广泛应用11。因此，本研究通过大肠杆菌表达系统制备 Sn 受体胞外区作为目标分子，利用 T7 噬菌体展示的纳米抗体文库中对其进行亲和筛选，以获得特异性结合 Sn 受体的纳米抗体分子，旨在为后续开展抗病毒活性研究打下基础。1材料与方法1 1试验材料菌株与载体:DH5a、BL21 DE3 大肠杆菌感受态细胞，购于诺唯赞公司;纳米抗体 T7 噬菌体展示文库、pET 30a(+)载体由笔者所在实验室保存。主要试剂:限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA连接酶均为宝生物公司产品;胶回收试剂盒为QIAGEN 公司产品;SDS PAGE 凝胶制备试剂盒，购自天根公司;HisTrap HP 层析柱，购自美国 GE 公司;其余试剂均为分析纯。主要仪器:台式离心机，购自美国 Beck man 公司;BTX 电转化仪、PCR 仪，购自宝生物公司;Geldoc It Imaging System，购自美国 UVP 公司。1 2重组表达载体 pET 30a Sn4D 的构建参考 GenBank 中上传的猪源 Sn 序列，并根据大肠杆菌表达系统进行密码子优化，由金斯瑞公司合成 Sn 受体 4 个免疫球蛋白样结构域(Sn4D)基因序列，并在该基因序列的上下游分别添加 Nde、Xho限制性酶切位点。利用上述酶切位点将 Sn4D基因插入原核表达载体 pET 30a(+)，双酶切鉴定和测序分析，将鉴定正确的重组载体命名为 pET 30a Sn4D 并导入 BL21 DE3 感受态细胞，冻存备用。1 3Sn4D 蛋白的表达与纯化挑取携带重组表达载体 pET 30a Sn4D 的大肠杆菌单菌落，37 摇床过夜培养，次日按 1 100比例转接新鲜 LB(Kan+)培养液，37 摇床培养至菌液 D600 nm=0 5，加入 IPTG 终浓度为 0 5 mmol/L，继续诱导培养 5 h，收获细菌，SDS PAGE 鉴定Sn4D 蛋白表达情况。利用 HRP Anti 6X His Tag抗体，Western blot 鉴定纯化蛋白的反应活性。根据 HisTrap HP 说明书，纯化目的蛋白，经 NanoDrop测定蛋白浓度。1 4纳米抗体文库筛选 Sn4D 特异性结合抗体取 10 L 纯化的 Sn4D 蛋白(100 g/mL)加入到 900 L NaHCO3(1 mol/L，pH 值=8 6)包被缓冲液中，100 L/孔包被酶标板，放置4 过夜。次日，PBST 缓冲液洗涤酶标板 1 次，加入 5%BSA 封闭液，37 封闭 2 h，PBST 缓冲液洗板 3 次。用包被缓冲液调整纳米抗体 T7 噬菌体展示文库至 1 1011PFU/mL 浓度，每孔加入 100 L 并于 37 孵育 1 h，使纳米抗体与 Sn4D 蛋白充分作用。回收反应溶液，PBST 洗涤酶标板 10 次，然后每孔加入100 L 1%SDS 溶液洗脱与靶蛋白结合的噬菌体。取10 L 洗脱产物经双层琼脂夹心法测定噬菌体滴度，剩余洗脱产物加入至对数生长早期的 BL21 宿主细菌中进行扩增，直至宿主细菌完全裂解。PEG NaCl 法回收扩增的噬菌体，调整回收的噬菌体浓度，重复上述筛选步骤 2 次，每轮筛选逐步降低Sn4D 蛋白包被量，同时增加 PBST 中 Tween 20 浓度，以获得高亲和力的纳米抗体。利用公式:产出比=(洗脱噬菌体量/投入噬菌体量)100%，计算每一轮筛选的得率。1 5阳性噬菌体的鉴定测定第 3 轮洗脱产物的滴度并从平板上随机挑取 72 个单克隆噬斑，用 T7 噬菌体特异性引物 T7Select UP Primer 5 GGAGCTGTCGTATTCCAGTC3和 T7 Select DOWN Primer 5 AACCCCTCAAGACCCGTTTA3进行噬斑 PCR 鉴定。挑选 PCR 阳性扩增产物送金斯瑞公司测序分析，用 DNAstar 软件分析纳米抗体氨基酸序列。1 6纳米抗体与 Sn4D 结合的亲和力、特异性测定根据序列分析结果，选取展示不同纳米抗体的噬菌体进行培养，回收噬菌体扩增产物，并统一调整浓度至 1 1010PFU/mL。分别向包被 Sn4D、BSA(50 ng/孔)酶标板中依次加入 100 L 噬菌体。37 孵育1 h 后，弃去反应液，PBST 洗涤酶标板10次，然后每孔加入 100 L 1%SDS 溶液洗脱与蛋白结合的噬菌体。双层琼脂法测定洗脱产物中噬菌体滴度，将 Sn4D 孔洗脱噬菌体量设为 P、BSA 孔洗脱噬菌体量设为 N，计算 P/N 值，比较不同纳米抗体与目标蛋白结合的特异性及亲和力强弱。2结果与分析2 1重组表达质粒的构建与蛋白表达将人工合成的 Sn4D 基因插入原核表达载体781江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期pET 30a(+)构建重组表达载体 pET 30a Sn4D。由图 1 可知，通过 Nde、Xho双酶切鉴定切出约 1 300 bp 目的条带，大小与预计相符合。序列测定结果显示，插入的 Sn4D 基因片段序列完全正确，阅读框无移码。IPTG 诱导携带重组表达载体的大肠杆菌。由图 2 可知，SDS PAGE 检测可见大小约 50 ku 的疑似 Sn4D 蛋白表达，通过超声波破碎分析发现该蛋白主要以包涵体的形式存在。2 2Sn4D 蛋白鉴定与纯化由图3 可知，将回收 Sn4D 包涵体通过变复性处理，然后经 HisTrap HP 柱纯化得到条带相对单一的纯蛋白(图3 A);Western blot 检测显示，目标蛋白与 HRP Anti 6X His Tag 抗体呈现良好的反应性(图3 B)。将Ni 柱纯化回收的蛋白经NanoDrop 测定含量，并调整浓度至 100 g/mL，80 冻存备用。2 3Sn4D 特异性重组噬菌体筛选将纯化后的 Sn4D 蛋白作为靶分子并包被在固相载体上，使 T7 噬菌体展示的纳米抗体与之结合。由表 1 可知，筛选过程中包被的靶分子用量逐轮降低，而洗涤液 PBST 中 Tween 20 含量逐渐升高，通过加压筛选有利于获得高亲和的纳米抗体分子。第 1 轮筛选产出比仅为 0 072%，而第 2 轮筛选则提高到 1 27%，第 3 轮进一步降低了投入噬菌体的量，但仍有 1 13%产出比，因此经过 3 轮筛选特异性结合 Sn4D 蛋白的噬菌体得到有效富集。表 1亲和筛选过程中噬菌体的富集亲和筛选(轮)Sn4D(ng)Tween 20(%)投入噬菌体量(PFU)洗脱噬菌体量(PFU)产出比(%)11000 051 0 101072 10600722500 101 0 1010127 10812703250 2010 109113 10711302 4单克隆噬菌体的鉴定纳米抗体基因插入在 T7 噬菌体衣壳蛋白 p10B基因下游，融合表达的衣壳蛋白在组装成 T7 噬菌体头部的同时将纳米抗体展示于表面。通过 PCR方法检测插入位点的纳