DB12T 1019—2020猪德尔塔冠状病毒 RT-PCR 检测方法.pdf

DB12/T1019-20207.2RNA提取7.2.1用Trizol提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的NA。取200L的样品和800 L Trizol置于一个1.5ml离心管，反复颠倒混匀，室温静置5min。7.2.2向各管中加入200L28预冷的氯仿，剧烈震荡15s,室温静置5min。7.2.312000rpm/min,4下离心15min,将每管中的上层含RNA的水相转移到个新的1.5mL离心管中。7.2.4向管中加入等体积28预冷的异丙醇，充分混合液体，室温静置15min。在12000rpm/min4下离心15min,弃去上层的清液。7.2.5用冰冷的DEP处理的75%乙醇洗涤沉淀，温和震荡离心管，12000rpm/min,4离心10min,吸去上层清液。7.2.6打开离心管管盖，在室温下放置5min10min,加入50LDEP心C水。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，需置于-80的冰箱保存。7.2.7也可采用商品化的NA提取试剂，按照说明书进行操作。同时进行阴阳对照样品NA的提取。7.3反转录反应(cDNA的合成)将上述步骤所得的病毒总RNA进行反转录反应。反转录体系为：5MLV缓冲液4L,氯化镁2L,dNTP2L,随机引物1L,M-MLV反转录酶0.5uL,Rnase抑制剂0.5L,RNA10L。反转录反应条件为：3010min,421h,995min。得到的cDNA溶液直接用于下面的PCR扩增或者-20冻存备用。7.4PCR反应将上述步骤得到的样品cDNA进行PCR反应。PCR反应体系为：10 xr Taq Buffer2uL,氯化镁1L,dNTP2L,上游引物P11L,下游引物P21L,cDNA4L,rTag0.5L,加入灭菌双蒸水定容至最终总体积20uL。充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。PCR反应条件为：945min:9430s,6030s,7230s,30 cycles;727min。7.5电泳及观察将PCR扩增产物8L与2！.上样缓冲液混合，点样于1%琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000 DNA Marker(分子质量标准物)，电泳缓冲液为1XTAE,电泳条件为100V,20min左右。将电泳产物取出，置于凝胶成像系统下观察并拍照，以分子质量标准为参照判断扩增产物大小。8结果判定8.1质控标准当阳性对照出现359b扩增条带，阴性对照未出现目的条带，阴性、阳性同时成立表明实验结果有效，否则实验无效。8.2结果判定结果判定如下：一一阴性：被检样品未出现359bp扩增条带，判为PDCoV核酸阴性，如图1所示：一一阳性：被检样品出现359bp扩增条带，判为PDCoV核酸阳性，如图1所示。3