肝郁对围绝经期综合征大鼠认...功能及脑组织氧化应激的影响_沈建英.pdf

福建中医药 2023 年 1 月 第 54 卷 第 1 期Fujian Journal of TCM January 2023，54（1）肝郁对围绝经期综合征大鼠认知功能及脑组织氧化应激的影响沈建英1，2，梁文娜1，2，张凌媛1，2，丁珊珊1，2，康洁1，2，赵田1，陈燕1，刘圣洋1，杨敏1，2，龚琳 1，2*（1.福建中医药大学中医证研究基地，福建 福州 350122；2.福建省中医健康状态辨识重点实验室，福建 福州 350122）摘要：目的观察围绝经期综合征大鼠在肝气郁结的状态下其认知行为及抗氧化应激能力的改变。方法通过生理周期和旷场行为筛选出12月龄围绝经期综合征SD大鼠32只，采用随机数字表法按体质量分层将大鼠分为对照组（n12）和模型组（n20）。模型组采用慢性束缚应激结合孤养法建立围绝经期综合征肝郁大鼠模型，最后成模大鼠12只；对照组以每笼4只进行群养。采用Morris水迷宫的定位航行实验及空间探索实验分别检测2组大鼠的记忆保持能力及空间学习能力。检测2组大鼠前额叶皮质及海马超氧化物歧化酶（SOD）的活力、丙二醛（MDA）含量评价其抗氧化应激能力。结果造模前，2组大鼠皮毛色泽光亮，精神状况良好，活动反应灵敏；造模后，对照组大鼠体征无明显变化，模型组大鼠则表现出食欲下降、粪便稀软、反应迟钝、精神萎靡、焦躁不安、偶有嘶叫等现象。与对照组比较，模型组造模后大鼠血浆的ACTH和CORT含量明显升高（P0.01）；糖水消耗率明显下降（P0.01）；旷场实验水平得分和垂直得分也明显下降（P0.01）；平均逃避潜伏期明显延长（P0.01）；空间探索实验中在第三象限的平均停留时间明显缩短（P0.01）；海马及前额叶皮质组织SOD活力明显下降（P0.01），MDA含量明显上升（P0.01）。结论肝郁会导致模型组SD大鼠认知功能减退及抗氧化应激能力下降，提示肝郁可能会加速围绝经期综合征大鼠脑组织衰老的进程。关键词：围绝经期综合征；肝郁；脑衰老；认知行为；氧化应激女性患抑郁症的比例大约是男性的2倍1，到了围绝经期甚至高达 5 倍2。女性进入围绝经期后容易出现抑郁、焦虑及健忘等情志异常的表现。前期研究表明，肝气郁结是围绝经期综合征的主要病理过程之一3-4。肝失疏泄是导致脑老化的重要因素之一5-6，可以通过调补肝气及疏肝解郁调节机体氧化失衡状态或提升端粒酶活性6-7，改善学习认知功能，从而延缓衰老进程。近年来关于应激加速衰老的研究逐渐受到越来越多学者的关注8。然而，目前大多数研究仍使用雄性动物作为研究对象9-10，而对雌性动物尤其是围绝经期大鼠的报道相对较少。因此，本研究采用慢性束缚应激联合孤养法建立围绝经期综合征大鼠肝郁模型，利用水迷宫实验来检测学习记忆能力，评价其抗氧化应激能力，从而进一步阐明围绝经期综合征肝郁对脑衰老进程的影响。1实验材料1.1实验动物9 月龄健康 SPF 级雌性 SD 大鼠32只，体质量（43030）g，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。所有动物饲养于福建中医药大学实验动物中心，动物房温度控制在（222），相对湿度55%70%，采用 8AM/8PM 交替的 12 h 照明方式，自由摄食和饮水，正常饲养至12月龄。1.2实验试剂促肾上腺皮质激素（adrenocor ticotropic hormore，ACTH）、皮质酮（corticostrone，CORT）试剂盒（美国 CUSABIO 公司，货号：CSB-E06875r、CSB-E07014r）；超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A001-3、A003-1）；BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术有限公司，货号：P0012S）；冰乙酸（西陇化工股份有限公司，货号：1270570201600）；95%乙醇（国药-沪试，货号：10009164）。1.3实验仪器SMG-2型Morris水迷宫（北京医学科学院药研所）；infinite M200 Pro 型连续波长多功能酶标仪（奥地利Tecan公司）；5810R型离心机（德国Eppendorf公司）。2实验方法2.1造模采用慢性束缚应激结合孤养法建立围绝经期综合征肝郁大鼠模型。造模期间，对大鼠进行孤养，束缚应激时间为 6 h（约 9：0015：00），连续束缚42 d。束缚造模具体方法如下，将大鼠置于特制的束缚筒内，束缚器呈管状，长约 20 cm，筒口内径7.0 cm，前端为通气孔，尾端为可关闭的盖子。管壁有若干通气孔，使大鼠能够自由呼吸与排泄。采用旷场实验和糖水偏好实验来观察大鼠焦虑样及抑郁样行为的改变，并结合体征变化筛选出旷场收稿日期：2021-12-18基金项目：国家自然科学基金项目（82174248，81774209）；福建省自然科学基金项目（2022J01362）；福建中医药大学基础类学科科研提升计划项目（XJC2022012）；福建中医药大学创新创业训练计划项目（201710393022，201810393010，201910393022）通信作者：龚琳，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0100620沈建英 等：肝郁对围绝经期综合征大鼠认知功能及脑组织氧化应激的影响第 1 期实验水平得分、垂直得分及糖水消耗率明显下降的大鼠，视为造模成功11。2.2分组造模前连续10 d观察雌性SD大鼠动情周期，筛选出动情周期紊乱的36只围绝经期综合征大鼠，同时利用旷场实验对每只大鼠进行行为学评分，水平运动和垂直运动总得分30分和150分的大鼠予以剔除，选择各项行为学指标得分相近的围绝经期综合征大鼠32只，采用随机数字表法按体质量分层将大鼠分为对照组（n12）和模型组（n20）。模型组按“2.1”项下造模方法建立围绝经期综合征肝郁大鼠模型，对照组以每笼 4 只进行群养，除造模及行为测试时段所有动物给予自由进食与饮水。最后造模组筛选出成模大鼠12只。2.3ACTH 及 CORT 含量检测于造模结束后，各组大鼠禁食不禁水 12 h，依次用 2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，用EDTA抗凝剂的采血管收集血液，室温静置30 min，于4 下3 000 r/min离心10 min，分装后置于-80 冰箱保存。ACTH及CORT含量测定按试剂盒说明书操作步骤进行。2.4水迷宫实验分别于造模前5 d和造模第37天上午9：0011：00对2组大鼠进行Morris水迷宫测试。水迷宫被平均分为 4个象限，站台置于第 3象限。实验分为定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验历时共 4 d，每天训练 4次，第 1天将大鼠面向池壁从第 1象限的中点处入水，第 2天从第2象限的中点处入水，以此类推。观察并记录大鼠在 60 s内寻找水下平台的时间，即逃避潜伏期，若60 s内仍未找到平台，逃避潜伏期记为60 s，并将动物引导到平台上熟悉环境并休息10 s，再进行下一次测试，分别计算每天逃避潜伏期的平均值。空间探索实验历时 1 d，于第 5 天进行，撤除水下平台后，将大鼠面向池壁从第 1 象限的中点处入水，记录其在 60 s 内第 3 象限的活动时间及穿越原平台所在位置的次数。2.5脑组织 SOD、MDA 含量测定腹主动脉取血后立即断头，快速将分离下来的全脑组织置于冰盘上，迅速切除前额叶皮质并剥取海马，将组织用冻存管收集，称重结束后立即置于液氮中速冻，-80 保存备用。采用黄嘌呤氧化酶法及硫代巴比妥酸法检测 SOD 和 MDA 含量，按试剂盒说明书操作步骤进行。2.6统计学方法采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布以（x s）表示，组内比较采用配对样本 t检验，组间比较采用独立样本 t检验；组内不同时间点比较采用重复测量方差分析。P0.05为差异有统计学意义。3结果3.12组大鼠体征及血浆中ACTH和CORT含量比较造模前，2 组大鼠皮毛色泽光亮，精神状况良好，活动反应灵敏。造模后，对照组大鼠体征无明显变化，模型组大鼠则表现出食欲下降、粪便稀软、反应迟钝、精神萎靡、焦躁不安、偶有嘶叫等现象。同时，模型组大鼠血浆的 ACTH 和 CORT 含量较对照组均明显升高（P0.01），见图1。3.22组大鼠糖水消耗率和矿场实验得分比较与对照组比较，模型组大鼠造模后糖水消耗率明显下降（P0.01），旷场实验水平和垂直得分也明显下降（P0.01）。见图2、图3。3.32 组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期比较在基线水平，随着训练次数的增加，模型组大鼠的平均逃避潜伏期逐渐缩短。造模结束后，模型组的平均逃避潜伏期较对照组显著延长（P0.01），见图4。1086420ACTH/（pg/mL）1）对照组模型组对照组模型组1）43210CORT/（ng/mL）注：与对照组比较，1）P0.01。图 1 2组大鼠血浆 ACTH 和 CORT 含量比较100806040200蔗糖消耗率/%1）对照组模型组造模前造模后注：与对照组比较，1）P0.01。图 2 2组大鼠糖水消耗率比较21福建中医药第 54 卷3.42 组大鼠空间探索实验中在第 3 象限的平均停留时间比较造模结束后，与对照组比较，模型组大鼠空间探索实验中在第 3 象限的平均停留时间明显缩短（P0.01），见图5。3.52 组大鼠海马和前额叶皮质组织 SOD 活力和MDA 含量比较与对照组比较，模型组海马及前额叶皮质组织SOD活力明显下降（P0.01），MDA 含量明显上升（P0.01）。见图6。100806040200水平得分/分1）对照组模型组造模前造模后20151050垂直得分/分1）对照组模型组造模前造模后注：与对照组比较，1）P0.01。图 3 2组大鼠旷场实验水平和垂直得分比较6040200逃避潜伏期/s1）对照组模型组造模前造模后对照组模型组1）1）1）2520151050逃避潜伏期/s1 2 3 4时间/d1 2 3 4时间/d注：与对照组比较，1）P0.01。图 4 2组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期比较2520151050时间/s对照组模型组造模前造模前1）注：与对照组比较，1）P0.01。图 5 2组大鼠空间探索实验中在第 3象限 的平均停留时间比较3002001000SOD/（U/mgprot）对照组模型组海马前额叶皮质1）1）对照组模型组海马前额叶皮质1）1）151050MDA/（nmol/mL）注：与对照组比较，1）P0.01。图 6 2组大鼠海马和前额叶皮质组织 SOD 活力和 MDA 含量比较22沈建英 等：肝郁对围绝经期综合征大鼠认知功能及脑组织氧化应激的影响第 1 期4讨论女子以肝为先天，肝功能失调、情志异常是加速机体衰老的重要原因之一12。本研究进一步探讨了肝郁对围绝经期综合征大鼠脑衰老进程的影响，结果表明，慢性束缚应激结合孤养法可以复制围绝经期综合征肝郁大鼠模型，对学习及空间记忆能力造成明显的损伤，海马和前额叶脑组织抗氧化应激能力显著下降。提示肝郁会在一定程度上加速围绝经期综合征大鼠脑衰老的进程，这也与国内学者提出“肝失疏泄致脑老化”的假说5及国外学者提出脑衰老的应激学说13相一致，从而进一步丰富了“因郁促衰”的相关理论假说。慢性应激或糖皮质激素（glucocorticoid，GC）过高均会加速大脑的衰老进程，并最终导致脑损伤。皮质酮（CORT）是啮齿动物中最主要的GC，对海马神经元的伸长、分化及其生理功能有直接的影响。临床研究也发现，GC 含量高的患者记忆力受损明显14，MDD 患者常伴有认知障碍，其症状与 AD 患者相似15。另外，长期注射GC会损伤皮层及海马，导致海马体积减小16。水迷宫实验能较准确地反映大鼠的空间学习记忆能力，其中定位搜索实验是用来测试记忆保持能力，空间搜索实验用来测试空间学习能力。本研究发现，造模结束后模型组大鼠在定位航行实验中的平均逃避潜伏期显著延长，在第3象限的平均停留时间显著