干姜与大枣提取物对酸冷刺激...菌群属水平和代谢功能的影响_杨峥.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 853 干姜与大枣提取物对酸冷刺激大鼠消化道菌群属水平和代谢功能的影响杨峥1，牛婷立2，王轩3，吕晓燕1，芦煜1，洪洁薇1，司银楚1，马良宵1，李海燕1，朱庆文1，贺立娟1，徐荣廷1，牛欣1，杨学智1（1北京中医药大学，北京 100029；2北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；3山西中医药大学，太原 030619）摘要：目的：观察干姜、大枣提取物调节酸冷刺激后大鼠口腔、胃、小肠、大肠消化道菌群变化以及菌群代谢功能预测。方法：随机将30只SD大鼠分为对照组、醋酸组和醋酸药物组，每组10只。对照组正常饮食。醋酸组采用pH浓度为3.9、温度为4 的醋酸进行灌胃。醋酸药物组给予干姜、大枣提取物灌胃。灌胃10 d后，分别取口腔、胃、小肠、大肠内容物，检查各组大鼠在酸冷刺激后菌群属水平的变化。结果：消化道菌群属水平变化，酸冷刺激后，各部位的益生菌、致病菌结构和多样性均有改变（P0.01，P0.05），在干姜、大枣提取物干预后，致病菌大致呈现抑制趋势（P0.01，P0.05）。胃部菌群，有7条通路醋酸组的丰度值较高。大肠菌群，有10条通路醋酸药物组的丰度值较高。结论：酸冷刺激导致消化道菌群属水平变化和代谢功能更加活跃，干姜大枣提取物对大鼠肠道菌群紊乱具有调节作用。关键词：肠道菌群；消化道；酸冷刺激；菌群；属水平；代谢；干姜；大枣基金资助：国家自然科学基金面上项目（No.81873211，No.81473553）Effects of dried ginger and jujube extract on the genus level of digestive tract microflora and metabolic function in digestive tract of acid-cold stimulated ratsYANG Zheng1,NIU Ting-li2,WANG Xuan3,LYU Xiao-yan1,LU Yu1,HONG Jie-wei1,SI Yin-chu1,MA Liang-xiao1,LI Hai-yan1,ZHU Qing-wen1,HE Li-juan1,XU Rong-ting1,NIU Xin1,YANG Xue-zhi1(1Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital,Beijing 100029,China;3Shanxi University of Chinese Medicine,Taiyuan 030619,China)Abstract:Objective:To observe the effects of dried ginger and jujube extracts on the changes of digestive tract microflora and the prediction of bacterial metabolic function in the digestive tract of oral cavity,stomach,small intestine and large intestine in SD rats stimulated by acid cold.Methods:Thirty SD rats were randomly divided into control group,acetic acid group and acetic acid administration group,with 10 rats in each group.The control group ate a normal diet.Fixed acetic acid at pH 3.9 and temperature 4 was used for gavage.The acetic acid administration group was gavaged with dried ginger and jujube extract.After 10 days of gavege,the contents of oral cavity,stomach,small intestine and large intestine were taken respectively to check the changes of microflora level in each group after acid chilling stimulation.Results:Genus level changes of digestive tract flora,after acid chilling stimulation,the structure and diversity of probiotics and pathogenic bacteria were changed(P0.01,P0.05),after the intervention of dried ginger and jujube extract,the pathogenic bacteria showed a trend of inhibition(P0.01,P0.05).There 研究报告通信作者：牛欣，北京市朝阳区北三环东路11号北京中医药大学，邮编：100029，电话：010-64286956，E-mail：牛婷立，北京市朝阳区安定门外小关街51号北京中医药大学第三附属医院，邮编：100029，电话：010-52075600E-mail：zeromag-内文2.indd 8532023/2/28 10:36:37中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 854 were 7 channels of gastric flora,and the abundance value of acetic acid group was higher.Coliform,with 10 pathways,had a higher abundance value in the acetic acid group.Conclusion:Acid-cold stimulation results in changes in the level of gastrointestinal flora and more active metabolic function.The extract of dried ginger jujube can regulate the intestinal flora disorder in rats.Key words:Intestinal flora;Digestive tract;Acid-cold stimulation;Microflora;Genus level;Metabolism;Dried ginger;JujubeFunding:General Program of National Natural Science Foundation of China(No.81873211,No.81473553)消化道内微生物既有适应于酸性环境的，也有适应于碱性环境的。口腔、胃pH值较低，从十二指肠往下消化道pH值多偏向于碱性。不同种类的细菌在数量、比例、定位等方面的消长变化，构成了肠道微生态系统的演化基础，其动态平衡对宿主健康起着重要作用。目前，关于长期饮食酸冷对肠道菌群变化的研究报道甚少。故本实验依据中医“五味”理论，以“酸”“冷”醋酸灌胃刺激大鼠口腔和胃肠道，观察在脾胃功能虚弱的状态下，分析大鼠口腔、胃、小肠、大肠菌群，以及分类水平结构、多样性。运用干姜、大枣提取物干预过食酸冷大鼠，探讨长期酸冷刺激对机体的影响，以及干姜、大枣提取物对其的治疗效果，从而更深层次地了解饮食不节。材料与方法1.动物 SPF级雌性SD大鼠30只，1.5月龄，体质量190220 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，动物使用许可证编号：SYXK（京）2016-0002；适应性饲养于中国中医科学院中药研究所SPF级动物房5 d后备用。控温2226、控湿60%70%、控光（光照12 h/d，8：0020：00）的环境下自由进食和饮水。本实验获得中国医学科学院批准（实验伦理第20182007号），并符合实验动物福利和伦理的相关规定。2.药物、试剂与仪器 干姜、大枣提取物（山西中医药大学提供）。pH值为3.9、温度为4 的醋酸（批号：GB/T18187，山西水塔醋业股份有限公司）。FLx800荧光分析仪（美国伯腾仪器有限公司）；Illumina MiSeq测序平台（上海派森诺生物科技有限公司）；QIAam DNA迷你试剂盒（德国凯杰生物技术有限公司）；凝胶回收试剂盒（美国AXYGEN公司）。3.分组与灌胃 将30只雌性SD大鼠随机分为对照组、醋酸组和醋酸药物组，每组10只。除对照组正常饮食饮水外，其余两组每天下午按照10 mL/kg剂量灌胃醋酸，连续10 d；醋酸药物组每天早上按照1 mL/100 g灌胃干姜、大枣提取物。4.16S rRNA实验流程4.1 标本获取 灌胃10 d后，7%水合氯醛按0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉处死大鼠，用镊子夹取口腔、胃、小肠、大肠内容物，将此四部位菌群样品送至测试机构（上海派森诺生物科技股份有限公司），采用“16S rRNA基因区”V4段检测分析方法进行消化道菌群的检测分析。4.2 微生物组总DNA提取 从样品中提取总微生物基组DNA，按照粪便DNA提取试剂盒QIAam DNA迷你试剂盒操作步骤进行提取。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。得到纯化的基因组DNA后，采用紫外分光光度计分别检测总DNA在260 nm和280 nm两处的吸光度，观测总DNA的浓度和OD260/OD280的比值。纯化的基因组-20 存放待测。4.3 目标片段PCR扩增与纯化 将无菌水稀释DNA样品至 1 ng/L作为模板，用带Barcode的特异引物对粪便细菌16S V4区进行PCR扩增。通过2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，使用凝胶回收试剂盒对目标片段进行切胶回收。4.4 扩增产物荧光定量 参照电泳初步定量结果，将PCR扩增回收产物进行荧光定量，荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为荧光分析仪，根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，各样本按相应的比例进行混合。4.5 文库制备和高通量测序 采用Illumina公司的TruSeg Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，构建好的文库经过Quhit和Q-PCR定量，文库合格后，使用Illumina MiSeq进行上机测序。5.统计学方法 采用SAS 9.4统计软件进行分析，若服从正态分布，则使用样本独立t检验：若不服从正态分布，则使用非参数分析；P0.05表示差异有统计学意义。5.1 属水平的差异 使用Mothur软件，调用Metastats的统计学算法，对物种组成的序列量（即绝对丰度）差异有统计学意义的组别从菌属水平进行菌群分析，进行两两比较检验。5.2 菌群代谢功能预测 采用PIRUST-菌群代谢功能预测工具，通过将现有的16S rRNA基因测序数据与代谢功能已知的微生物参考基因组数据库相比，从而实现对菌群代谢功能的预测。KEGG的比对结果进行相应的分析，核心为生物代谢通路分析数据库。菌群代谢功能预测为各样本