肝细胞核因子FOXA2通过...制氧化应激减轻小鼠肝纤维化_姚荔嘉.pdf

doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.01.013基金项目:福建医科大学启航基金项目(2021QH1324);国家自然科学基金重点项目(81530019);联勤保障部队第九医院院立课题(2019L04)第一作者简介:姚荔嘉,主治医师,硕士,研究方向:肝纤维化、胃食管反流病、消化道早癌疾病诊治。E-mail:18701745163 通讯作者:李东良,主任医师,教授,博士生导师,研究方向:病毒性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭等肝胆疾病诊治。E-mail:dongliangli93 肝细胞核因子 FOXA2 通过抑制氧化应激减轻小鼠肝纤维化姚荔嘉1,2,王宝珊1,王雯1,李东良11.福建医科大学福总临床医学院,福建 福州 350025;2.海军军医大学(第二军医大学)长征医院消化内科【摘要】目的探究调控肝细胞叉头框转录因子 A2(forkhead box transcription factor A2,FOXA2)表达对肝纤维化小鼠体内氧化应激(oxidative stress,OS)指标的影响。方法 通过对小鼠进行腹腔注射 CCl4建立肝纤维化模型,选取 FOXA2loxP/loxP雄性小鼠 18 只,随机分为正常组、对照组和 FOXA2H-KO组,每组 6 只,造模后 FOXA2H-KO组基于 LoxP-Cre 重组系统经尾静脉注射腺相关病毒 AAV8-TBG-Cre,对照组注射对照病毒 AAV8-TBG;另取 18 只 C57BL/6J 雄性小鼠随机分为 3 组,每组 6 只,分别为正常组、对照组和 FOXA2 组,造模后 FOXA2 组经尾静脉注射病毒 AAV8-TBG-FOXA2,对照组小鼠注射 AAV8-TBG 病毒。通过 qPCR 检测各组小鼠肝组织中 TGF-1 mRNA 变化,丙二醛(malondialdehyde,MDA)比色法检测肝组织中 MDA 的含量,Western blotting 法检测各组肝脏中 3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)蛋白变化。结果 与正常组相比,CCl4造模可显著增加肝组织中 TGF-1 mRNA 的表达,并导致肝组织中 MDA、3-NT 水平升高,诱发小鼠体内的OS;敲除肝细胞 FOXA2 后可促进小鼠纤维化肝组织中 TGF-1、MDA 及 3-NT 水平进一步升高,差异有统计学意义(P0.01);而上调肝细胞FOXA2 表达可明显减少纤维化肝组织中 TGF-1 表达(P0.05),并显著抑制 OS 相关指标(MDA、3-NT)升高(P0.01)。结论调控肝细胞 FOXA2 可影响肝纤维化小鼠体内的 OS 水平,FOXA2 可能通过抑制 OS 发挥抗纤维化作用。【关键词】FOXA2;肝纤维化;氧化应激中图分类号:R575文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)01-0059-06收稿日期:2022-01-12Hepatocyte nuclear factor FOXA2 attenuates hepatic fibrosis in mice by inhibiting oxidative stressYAO Lijia1,2,WANG Baoshan1,WANG Wen1,LI Dongliang11.The Fuzong Clinical Medical College,Fujian Medical University,Fuzhou 350025;2.Department of Gastroenterology,Changzheng Hospital,Naval Medical University(the Second Military Medical University),China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of forkhead box transcription factor A2(FOXA2)on oxidative stress(OS)in fibrotic livers induced by CCl4 in mice.MethodsThe mice were recruited to establish a kind of liver fibrosis animal model by injecting with CCl4 intraperitoneally.Eighteen FOXA2loxP/loxP male mice were randomly divided into nor-mal group,control group and FOXA2H-KO group,with 6 mice in each group.The mice in FOXA2H-KO group were injected with the AAV8-TBG-Cre,while the mice in control group were injected with control vector AAV8-TBG by tail vein injec-tion.Eighteen C57BL/6J male mice were divided into normal group,control group and FOXA2 group(n=6).After trea-ting with CCl4,the mice in FOXA2 group were injected with AAV8-TBG-FOXA2,while the control mice were injected with AAV8-TBG.The mRNA expressions of TGF-1 were measured by qPCR.The levels of malondialdehyde(MDA)in liv-er tissues were detected by corresponding assay kits.Western blotting was performed to determine the protein of 3-nitrotyrosine(3-NT).ResultsCompared with normal group,CCl4 treatment could increase the mRNA of TGF-1 and the indica-tors of OS(MDA and 3-NT)in the fibrotic livers of control group.Knockout FOXA2 in hepatocytes could further aggra-vate significantly the increasing of TGF-1,MDA and 3-NT in fibrotic livers(P0.01).While upregulation of FOXA2 in hepatocytes remarkably inhibited the TGF-1 mRNA(P0.05)and OS-related indexes(MDA and 3-NT)(P0.01)in fibrotic livers contrasted with the control mice.ConclusionModulating FOXA2 in hepatocytes influences OS in hepatic fibrosis of mice.FOXA2 has therapeutic potential for treating hepatic fibrosis via inhibiting OS.【Key words】FOXA2;Hepatic fibrosis;Oxidative stress95胃肠病学和肝病学杂志2023 年 1 月第 32 卷第 1 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Jan 2023,Vol.32,No.1叉 头 框 转 录 因 子 A2(forkhead box transcription factor A2,FOXA2),也称肝细胞核因子 3(hepatocyte nuclear factor 3,HNF3),属于 HNF3 转录调节因子的家族成员之一,在肝脏细胞中优势表达,其在胆管发育、肝细胞分化、维持胆汁酸稳态和糖脂代谢平衡中发挥重要作用1-4。本课题组前期已发表的研究成果证实,FOXA2 在人类和小鼠的纤维化肝脏组织中表达均下降。我们通过四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)(0.25 ml/kg)腹腔注射构建小鼠肝纤维化模型,甲状腺素结合球蛋白(thyroxine binding globulin,TBG)为成熟肝细胞特异性表达蛋白,基于 LoxP-Cre 重组系统经尾静脉注射包含TBG 启 动 子 的 腺 相 关 病 毒(adeno-associated virus,AAV),该 病 毒 AAV8-TBG-Cre 特 异 性 敲 除 肝 细 胞FOXA2 后可加重小鼠肝纤维化病变程度;而通过病毒AAV8-TBG-FOXA2 上调肝细胞 FOXA2 表达可减轻肝纤维化;并初步探讨了 FOXA2 抗肝纤维化的机制,肝细胞FOXA2 可能通过抑制内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)诱导的肝细胞凋亡缓解肝纤维化5。既往大量研究证据表明氧化应激(oxidative stress,OS)与ERS 密切相关,OS 过程中产生的活性氧(reactive oxy-gen species,ROS)参与 ERS 介导的细胞凋亡,且持续性的 OS 与蛋白质错误折叠可触发机体内的凋亡级联反应,恶性循环加重组织器官的损伤6-7。基于肝细胞FOXA2 可通过抑制 ERS 发挥抗肝纤维化作用及 ERS与 OS 间的复杂交联关系,因此,本研究从 OS 角度探讨调控肝细胞 FOXA2 干预肝纤维化的作用机制。1材料与方法1.1实验动物FOXA2loxP雄性小鼠购自美国杰克逊实验室(货号:022620),委托上海南方模式生物科技股 份 有 限 公 司 进 行 杂 交、繁 育 后 得 到 基 因 型 为FOXA2loxP/loxP的 纯 合 子 雄 性 小 鼠。随 机 选 取 18 只FOXA2loxP/loxP小鼠,清洁级,56 周龄时安全转移至海军军医大学(第二军医大学)动物实验中心培育(许可证号:SYXK(沪)2012-0003)。随机选取 18 只同系雄性小鼠(C57BL/6J),清洁级,67 周龄,由海军军医大学(第二军医大学)动物实验中心培育。1.2病毒与试剂采用含有 TBG 启动子的 AAV 载体 pENN-AVV-TBG-PI-RBG(Penn Vector Core,p1015-R)构建表达 Cre 的病毒 AAV8-TBG-Cre,该病毒基于LoxP-Cre 重组 系 统 可 特 异 性 敲 除 成 年 小 鼠 肝 细 胞FOXA2 基因;另构建腺相关病毒 AAV8-TBG-FOXA2特异性上调肝细胞 FOXA2 表达;对照病毒为 AAV-TBG;上述病毒均通过深圳百恩维生物科技有限公司进行包装与纯化后购入。CCl4购自国药集团化学试剂有限公司。SYBR Green PCR 试剂盒及逆转录酶链反应试剂盒均由 Takara 有限公司提供。脂质氧化检测试 剂 盒(S0131S)、Western 及 IP 细 胞 裂 解 液(P0013)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0010S)均购自上海碧云天生物技术有限公司。3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)抗体购自 Santa Cruz Biotechnology公 司(sc-32757);GAPDH 抗 体 购 自 Bioworld 公 司(AP0063)。4%15