干细胞外泌体对内皮细胞增殖迁移和血管生成的影响_陶苏皖.pdf

第 33 卷第 1 期2023 年 2 月生物技术Biotechnology33(1):81Feb.,2023 收稿日期:2022-01-10 基金资助:湖北省教育厅科学研究计划中青年人才项目(Q20201110);湖北省大学生创新创业训练项目(S202010488063);武汉科技大学研究生创新创业基金项目(JCX2020058)作者简介:陶苏皖(1996-),男,安徽省芜湖人,硕士,研究方向:生物医用材料,E-mail:。通讯作者:许娜(1987-),女,山东省枣庄人,博士,副教授,硕导,研究方向:纳米生物医用材料,发表 SCI 论文 20 余篇,E-mail:。干细胞外泌体对内皮细胞增殖迁移和血管生成的影响陶苏皖,钟晓,黎钗,杨江涛,赵晨辰,许娜(武汉科技大学 生命科学与健康学院,湖北 武汉 430065)摘要:目的探究脂肪间充质干细胞来源的外泌体对人脐静脉内皮细胞的迁移和血管生成的影响。方法利用超速离心法提取脂肪间充质干细胞来源的外泌体;通过透射电子显微镜观察外泌体的形貌;通过免疫印迹法检测外泌体的标志蛋白;通过动态光散射法检测外泌体水合粒径;通过 CCK-8 法检测外泌体对 HUVECs 增殖的作用;通过划痕实验和 Transwell 实验检测外泌体对 HUVECs 迁移的影响;通过血管生成实验评估外泌体诱导 HUVECs 生成血管的能力。结果脂肪间充质干细胞外泌体的平均水合粒径约为 151.9 12.3 nm,含有外泌体的标志蛋白 CD63、TSG101。外泌体浓度为 30 g/mL 时,共孵育48 h 后,EXO 组 HUVECs 的增殖率高于 NC 组14%;划痕实验中 NC 组的平均迁移率约为 0.45 0.05,EXO 组约为 0.63 0.05,EXO 组的迁移率显著高于 NC 组约为 0.18 0.07,而 Transwel 中 48 h 时 NC组的单位面积平均转移细胞数约为167 24,EXO 组约为728 49。4 h 的成血管实验显示外泌体组管的 NC 组平均结点数约为 495 52,EXO 组约为 658 76;NC 组单位图像平均分支长度约为 163 9 m,EXO 组约为 190 7 m。结论 脂肪间充质干细胞来源的外泌体可以促进 HUVECs 的增殖、迁移和成血管。关键词:脂肪间充质干细胞;外泌体;人脐静脉内皮细胞;迁移;血管生成中图分类号:Q28 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0013Effects of stem cell exosomes on endothelial cell proliferation,migration and angiogenesisTAO Su-wan,ZHONG Xiao,LI Chai,YANG Jiang-tao,ZHAO Chen-chen,XU Na(College of Life Sciences and Health,Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430065,China)Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of exosomes from adipose derived mesenchymal stem cells(ADMSCs)on themigration and angiogenesis of Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVECs).MethodThe exosomes were extractedfrom ADMSCs through ultracentrifugation;The morphology of exosomes was observed by transmission electron microscopy;Themarker proteins of exosomes were detected by Western Blot assay;The hydrated particle size of exosomes was detected by dy-namic light scattering;The effect of exosomes on HUVECs proliferation was evaluated by CCK-8 assay;The effect of exo-somes on HUVECs migration was evaluated by wound healing and transwell experiment;The effect of exosomes on the angio-genesis of HUVECs was evaluated by angiogenesis induction experiment.Result The average hydrated particle size of the ex-osomes of adipose mesenchymal stem cells was about 151.9 12.3 nm.It contains the marker proteins CD63 and TSG101.Theconcentration of exosomes was 30 g/mL,after 48 hours of incubation,the proliferation rate of HUVECs in EXO group was14%higher than that NC group;In the wound healing,the average migration rate of NC group was about 0.45 0.05,that ofEXO group was about 0.63 0.05,and that of EXO group was significantly higher than that of NC group was about 0.18 0.07,while the average number of transferred cells per unit area of NC group was about 167 24 and that of EXO group was a-bout 728 49 in transwell.The 4-hour angiogenesis experiment showed that the average number of nodes in NC group andEXO group was about 495 52 and 658 76 respectively and the average branch length of unit image in NC group was about163 9 m.Exo group was about 190 7 m.Conclusion The exosomes derived from ADMSCs can promote the prolifera-tion,migration,and angiogenesis of HUVECs.Keywords:adipose derived mesenchymal stem cells;exosomes;human umbilical vein endothelial cells;migration;angiogene-sis生 物 技 术2023 年 干细胞因其具有多向分化潜能和自我更新能力被广泛应用于损伤修复和组织再生,是再生医学研究的热点之一1-2。但是干细胞治疗也可能引起一系列安全问题,包括畸胎瘤的形成、移植物抗宿主病以及伦理问题3-4。外泌体是细胞旁分泌作用形成的具有双层膜结构的囊泡,直径约 30 nm 150nm5。研究证明,外泌体拥有与原细胞相似的膜结构和内含物,因而具有相似的功能。纳米级的尺寸使其具有很强的组织穿透能力,甚至可以穿过血脑屏障6-7。此外,外泌体还具有较低的免疫原性,具备良好的生物相容性,能有效避免免疫排斥。利用干细胞外泌体的再生能力,有效促进细胞增殖、迁移,进而促进损伤修复和再生,已经受到广泛的关注8。脂肪间充质干细胞(Adipose derived mesenchy-mal stem cells,ADMSCs)是一类来源于脂肪组织的干细胞,可分泌多种促血管生成因子、抗凋亡因子,具有抗炎、抗氧化、促进修复等功能9。相比其他种类间充质干细胞,脂肪间充质干细胞获取简单,其来源的外泌体被认为能够促进损伤修复和组织再生10-11。在组织修复的过程中,新血管的形成是关键步骤之一,而血管网络的重建承担了输送细胞生命活动所需的氧气和营养物质的功能。人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HU-VECs)通常可用来评估血管生成的情况。通过探索外泌体对 HUVECs 细胞活动的影响,反映其对血管生成的作用,为损伤修复和再生的研究奠定基础。刘珺碧等人12运用低强度脉冲超声联合 ADMSCs外泌体的策略探究其对血管内皮细胞血管生成的作用,表明该策略能促进新血管的生成。此外,有研究中利用低氧微环境诱导 ADMSCs 外泌体并与血管内皮作用,证明其能对细胞血管生成有积极作用13。同时脂肪间充质干细胞外泌体也被证明可以促进皮肤创面修复,而血管再生是创面修复过程中的重要指标之一14-15。笔者通过研究大鼠 ADMSCs 来源的外泌体对HUVECs 的作用,从细胞活力、细胞迁移、Transwell以及血管生成等多个方面,探索 ADMSCs 来源外泌体的功能,为其在损伤修复和组织再生方面临床应用提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料大鼠 ADMSCs 来自 SPF 级 SD 大鼠(4 周龄,约180 g)腹腔脂肪组织,将大鼠脂肪组织剪切后,利用胶原酶消化,然后在 DMEM 培养基中培养,经过 2 3 代传代纯化,即可获得提取的 ADMSCs。HUVECs购自北纳生物,液氮保存。1.1.2 试剂磷钨酸,AR,上海麦克林生化科技有限公司;CCK-8 试剂盒,MA0218-1,大连美仑生物技术有限公司;结晶紫,C0121,上海碧云天生物技术有限公司;基质胶,356234,美国 BD 公司;TSG101 抗体,67381-1-Ig 和辣根过氧化物酶(Horseradish Perox-idase,HRP)偶 联 的 Goat-Anti-Mouse 二 抗,SA00001-1,武汉三鹰生物技术有限公司;CD 63 抗体,sc-59286,Santa Cruz Biotechnology 公司;ECL 显色试剂盒,SQ201,上海雅酶生物科技有限公司。1.1.3 仪器透射电子显微镜,JEM-2100 UHR STEM/EDS,JEOL;纳米粒度及表面电位分析仪,ZEN3600 光源,英国马尔文公司;多功能酶标仪,SpectraMaxi3,Mo-lecular Devices;低温超速 离 心,OptimaXE-100,Beckman Coulter;显微镜,IX73P2F,Olympus;凝胶成像仪,Universal Hood,Bio-Rad。1.1.4 培养基DMEM16和 F12/DMEM17,美国 Gibco 公司;胎牛血清,AusGeneX 公司。采用含有10%胎牛血清的培养基培养细胞,无血清培养基收集外泌体。1.2 方法1.2.1 ADMSCs 外泌体的提取ADMSCs 用 T75 培养瓶扩大培养,细胞密度达到 80%,去除旧培养基,用 PBS 洗去残留培养基,每个培养瓶加入 20 mL 无血清培养基,在细胞培养箱中培养 48 h。收集细胞上清,按照 300