附子品质评价及影响因素研究进展_蒲婷婷.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化综述附子品质评价及影响因素研究进展蒲婷婷1，王宇飞1，周忠瑜1，严靖婷2，杨燕2，段宝忠1（1.大理大学药学院 大理 671000；2.云南省科学技术院 昆明 650051）摘要：附子为常用的大宗传统药材，其质量关系到用药安全性和有效性。本文对古代及现代附子的品质评价和影响因素进行了系统综述。研究发现，加工过程炮制不规范，以及相关标准缺乏，存在过度炮制，是导致附子饮片质量差异较大的原因；同时附子的质量控制标准不完善，如在附子重金属、农残、二氧化硫等有害物质，以及去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱等强心成分的质量控制方面均较为薄弱，应进一步加强相关研究，建立附子炮制质量规范；此外，种质、产地、栽培方式、采收、加工、贮藏及商品规格等均是影响附子品质的重要因素，这些因素与成分及功效的相关性尚需进一步深入，上述问题的阐明，是附子品质提升和科学评价体系建立的基础。关键词：附子 品质影响因素 有效性 安全性doi:10.11842/wst.20211206011 中图分类号:R283.1 文献标识码:A附 子 为 毛 茛 科 植 物 乌 头 Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效，用于亡阳虚脱，肢冷脉微，心阳不足，胸痹心痛，虚寒吐泻，脘腹冷痛，肾阳虚衰，阳痿宫冷，阴寒水肿，阳虚外感，寒湿痹痛1，是参附注射液、附子理中丸等300余种中成药的重要原料，其年需求量高达3000吨2。然而由于产地、栽培方式、采收时间和加工炮制等因素造成附子质量参差不齐3，严重影响了临床疗效和用药安全。近年来，有关附子的研究不断深入，已有学者对附子的化学成分、药理作用、质量控制等进行了研究4-5，亦有学者从附子的化学评价、生物评价、质量标准、炮制规范和检测方法等角度，对附子的品质评价进行了综述6-7，但尚未见从附子品质的有效性和安全性评价，以及附子品质影响因素的系统综述，限制了对附子品质提升和评价体系建立的认识。鉴于此，本文首次对古代和现代附子品质评价及影响因素进行系统总结，以期为附子品质提升和评价体系的建立提供科学参考。1 古代附子品质评价 古代附子品质评价始载于南北朝时期 雷公炮灸论，其认为底平、有九角、如铁色、一个个重一两，即是气全，堪用；此后宋代从角、节、花色角度评价附子品质，认为蹲坐正节角少，花色白为上；而明代则从肉色、皮色、角和形出发，认为色肉微黄，黑色顶全圆正者佳；清代从附子节、角、花色、皮色、产地和加工等角度，对附子品质评价方法进行了丰富，形成了以形态顶圆正底，角少，肉微黄，皮黑，花白为最佳的认识，详细见表1。2 现代附子品质评价 2.1附子的有效性评价2.1.1化学成分评价紫 外 分 光 光 度 法（Ultraviolet and visible 收稿日期：2021-12-06 修回日期：2022-06-08 云南省科技人才与平台计划院士专家工作站项目（202205AF150026）：滇产高品质中药材种质创新与规范化生产示范研究，负责人：段宝忠；云南省科学技术厅重大科技专项子课题（202002AA100007）：生物数字资源化开发应用，负责人：段宝忠；云南省人才工作领导小组高层次人才培养项目（YNWR-QNBJ-2020-251）：万人“青年拔尖人才”计划，负责人：段宝忠。通讯作者：杨燕，副研究员，主要研究方向：生物医药产业及大数据；段宝忠，教授，主要研究方向：中药资源与种质创新。4189 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 spectrophotometry，UV）主要用于附子中总生物碱含量的测定，如贝自英等8建立了酸性染料萃取光度法，用于附子中乌头碱和次乌头碱含量的测定，5-25 gmL-1，多位学者亦采用该法对附子及其炮制品中的总生物碱含量9-10和镁含量及溶出率11进行了测定，但由于该法灵敏度和准确性存在较大问题5，2015年版中国药典取消了该法用于总生物碱的检测。红外光谱法（Infrared absorption spectrometry，IRS）被广泛用于附子质量评价研究。如采用近红外光谱（Near-Infrared spectroscopy，NIRS），结合偏最小二乘和最小二乘支持向量机法，对38批附子进行了研究，发现LS-SVM模型的相对预测偏差4.0-8.8，验证集相关系数均在 0.95以上，表明 NIRS可用于附子中的单酯型和双酯型生物碱总量检测12；亦用于附子及炮制品中双酯型生物碱含量的快速测定13。此外，研究发现附子、黑顺片、白附片的近红外光谱特征存在差异14，与吴志生等15研究结果一致。NIRS方法操作简单，无需样品预处理，实现了快速、绿色分析的目的，逐渐得到推广应用。薄层色谱法（Thin layer chromatography，TLC）在中国药典2020年版、韩国药典-06均用于附子质量的评价，见表2；上述标准根据薄层色谱上附子提取液斑点的密度、颜色及位置来评价样品质量。曹玲丽等16建立了生附子中乌头碱的薄层色谱指纹图谱法，发现TLC法的7个特征斑点颜色深浅与HPLC含量测定结果基本相符，可用于生附子质量初步评价。此外，多位学者采用薄层色谱法，对附子中乌头碱分进行分离，发现该法分离效果良好，斑点清晰17-18。TLC法简单易行，准确性和稳定性较理想，但灵敏度低，且无法测定成分的具体含量。高 效 液 相 色 谱 法（High performance liquid chromatography，HPLC）是附子中生物碱成分检测最主要的方法，如2020年版中国药典、中国台湾中药材标准-03和中国香港中药材标准-07，均采用HPLC方法测定，并规定毒性成分含量上限和有效成分下限，详见表2。研究发现“一测多评法”可用于附子药材及同属植物的质量控制19-20，例如，Huang等21采用HPLC-ELSD法同时测定了5种醇胺型二萜生物碱。此外，指纹图谱技术也被用于附子的质量评价，多位学者建立了附子的HPLC指纹图谱，用于附子药材及其炮制品的质量控制22-24；研究显示不同采摘批次的生附子相似度0.9以上，各主要成分组成变化不大，但成分含量存在一定差异25。HPLC具有高速、高灵敏度、高分辨度等优点，因其能同时测定多种成分、结果准确而极受欢迎。液相色谱-质谱联用（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC/MS）被广泛用于附子中生物碱含量的测定。研究显示液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS）可用于乌头属中药的质量评价26-27，共检测出145个化表1附子历代品质评价年代南北南北吴越宋宋明明清清清清清清清品质评价底平、有九角、如铁色、一个个重一两，即是气全，堪用八月上旬采也，八角者良。其用灰杀之时，有冰强者并不佳附子大短有角平稳而实以八角者为上。岂令人种莳之法，用力倍至，故尔繁盛也附子之形。以蹲坐正节角少为上，有节多鼠乳者次之，形不正而伤缺风皱者为下；附子之色。以花白为上，铁色次之，青绿为下以八月上旬采，八角者良。肆售者以盐水浸之，取其润湿体重卖者，当以体色、干湿度、质地干坚实，顶圆正底平者为良体重而大实，色肉微黄皮黑，气雄壮，取黑色顶全圆正者佳。一枚重一两外，力大可用附子之形以蹲坐正节，而侧子少者为上，有节多乳者次之。形不正而伤缺风皱者为下。其色以花白者为上，黑色者次之，青色者为下皮黑体圆、底平八角、重一两以上者良必正节、角少、顶细、脐正者为上，顶粗、有节、多鼠乳者次之，伤缺偏绉者为下陕西出者为西附，四川出者为川附，川产为胜。以皮黑体圆、底平八角，顶大者良皮黑体圆，底平八角，重三两者良则附子之形，以蹲坐正节角少者为上，有节多鼠乳者次之，形不正而伤缺风皱者为下。之色，花白者为上，铁色者次之，青绿者为下体松而外皮多细块，以皮黑体圆底平，八角顶大者良出处雷公炮灸论本草经集注日华子本草本草图经彰明附子记本草原始药品化义本草崇原本草备要本经逢原本草从新本草求真本草述钩元本草害利4190 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化综述合物以及77个质量标志物28；LC/MS可用于测定没有紫外吸收的胺醇型二萜生物碱含量29；Zhang等30采用UPLC-MS技术从附子中鉴定出99个双酯型生物碱。此外，采用HPLC与电喷雾质谱联用技术检测附子研究显示，双酯型生物碱为附子主要成分，而单酯型生物碱的含量和种类较少31。相比于HPLC，LC/MS技术测定的成分种类、数量更加丰富，还能进一步确定生物碱结构。高效毛细管电泳法（High performance capillary electrophoresis，HPCE）亦被用于附子质量评价。韩乐等32建立了检测附子中新乌头碱、次乌头碱等6种生物碱含量的 HPCE 法，r20.9997，加样回收率 95.25%-103.91%，用于附子类药材内在质量的评价和控制；付昆等33建立了分析附子多糖中单糖组分的高效毛细管电泳法，结果显示该法灵敏度高，分离效果好。此外，Zhao等34发现较之传统方法，HPCE法的分离度好且显著提高分析效率，总分离时间只需13 min，但由于通常HPCE所采用的内径为75 m的毛细管色谱柱光程较短，其灵敏度受到影响。为增加化学成分信号响应强度，采用场放大进样-高效毛细管电泳（Field amplified sample stacking-high performance capillary electrophoresis，FASS-HPCE）法35，对10批附子饮片的指纹图谱进行了研究，结果显示采用FASS富集后，其检测灵敏度明显提高并在18 min内完成测定工作，可用于附子的质量评价。与HPLC法相比，HPCE法分析时间短、杂质干扰少、使用有机溶剂少、操作方便，是一种很有应用前景的分析方法。此外，采用酶联免疫吸附剂测定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA法），对川乌和附子中双酯型生物碱的含量进行了测定，发现与现行药典收载的表2各主要国家或地区对附子的质量规定标准来源中国药典中国香港中药材标准中国台湾中药材标准日本药典韩国药典指标苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱乌头碱、次乌头碱、新乌头碱乌头碱+次乌头碱+新乌头碱苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱乌头碱、次乌头碱、新乌头碱乌头碱结乌头碱次乌头碱新乌头碱-质量标准0.010%0.020%0.052%-0.18%0.010%0.020%0.006%0.006%0.028%0.014%斑点密度不能多于标准溶液-污染物监测对象-AsCrPbHg狄氏剂六六六滴滴涕六氯苯黄曲霉毒素总重金属AsPbAs-CrAsHg狄氏剂总六六六艾氏剂异狄氏剂总DDTSO2污染物限量标准（mgkg-1）-2.03.05.00.20.050.310.10.05105105-0.330.20.010.20.010.010.1304191 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 HPLC法相比，两者检