富血小板血浆的抑菌作用及其与抗菌肽含量的关系_郑勇.pdf

东南大学学报(医学版)J Southeast Univ(Med Sci Edi)2023，Feb;42(1):139-143 18VAZQUEZ，VAZQUEZ-GUILLAMET M C，SUAEZ J，etal Invasive mold infections in lung and heart-lung transplantrecipients:Stanford University experienceJ Transpl InfectDis，2015，17(2):259-266 19PAPPAS P G，ALEXANDE B D，ANDES D，et al Inva-sive fungal infections among organ transplant recipients:re-sults of the transplant-associated infection surveillance network(TANSNET)J Clin Infect Dis，2010，50(8):1101-1111 20CHONG P P，KENNEDY C C，HATHCOCK M A，et al Epi-demiology of invasive fungal infections in lung transplant re-cipients on long-term azole antifungal prophylaxisJ ClinTransplant，2015，29(4):311-318 21HUSAIN S，SILVEIA F P，AZIE N，et al Epidemiologicalfeatures of invasive mold infections among solid organ trans-plant recipients:PATH Alliance registry analysisJ MedMycol，2017，55(3):269-277 22STEINBACH W J，MA K A，ANAISSIE E J，et al Clinicalepidemiology of 960 patients with invasive aspergillosis fromthe PATH Alliance registryJ J Infect，2012，65(5):453-464 23 NEOH C F，SNELL G I，KOTSIMBOS T，et al Antifungalprophylaxis in lung transplantation:a world-wide surveyJ Am J Transplan，2011，11(2):361-366 24HUSAIN S，SOLE A，ALEXANFE B D，et al The 2015 In-ternational Society for Heart and Lung Transplantation Guide-lines for the management of fungal infections in mechanicalcirculatory support and cardiothoracic organ transplant recipi-ents:executive summary J J Heart Lung Transplant，2016，35(3):261-282 25PELIN D S，AUTEMAA-ICHADSON，ALASTUEY-IZQUIEDO A The global problem of antifungal resistance:prevalence，mechanisms，and managementJ Lancet InfectDis，2017，17(12):e383-e392 收稿日期2022-06-02修回日期2022-11-25 作者简介郑勇(1973 )，男，安徽六安人，副主任技师。E-mail:zhengyong9932 126 com 通信作者蔡娟E-mail:caijuan8533163 com 引文格式郑勇，秦宝磊，宋明珠，等 富血小板血浆的抑菌作用及其与抗菌肽含量的关系J 东南大学学报(医学版)，2023，42(1):139-143 论著 富血小板血浆的抑菌作用及其与抗菌肽含量的关系郑勇1，秦宝磊1，宋明珠2，蔡娟2(安徽医科大学附属六安医院 1 检验科，2 输血科，安徽 六安237005)摘要目的:探讨贫血小板血浆(PPP)、富血小板血浆(PP)及血小板凝胶上清液(PGS)对大肠埃希菌的体外抑菌作用及其与抗菌肽血小板因子 4(PF4)含量的关系。方法:从本市中心血站获取健康献血者的单采血小板作为 PP 来源，采用平板培养细菌法观察 PPP、PP 及 PGS 与大肠埃希菌共培养不同时间细菌生长情况，ELISA 检测 PPP、PP 及 PGS 中 PF4 的含量。结果:(1)PPP、PP 及 PGS 均可以抑制大肠埃希菌的生长。PPP、PP 在 18 h 内具有很强的抑菌作用，随后抑菌作用逐渐减弱，24 h 后逐渐失去抑菌作用;PGS 在 9 h 内具有抑菌作用，3 h 时抑菌作用最佳，随后抑菌作用逐渐减弱，12 h 时无抑菌作用。(2)凝胶缓释液也具有抑菌作用，抑菌时效同 PGS。(3)PPP、PP 和 PGS 中 PF4 质量浓度分别为(300 65 75 46)、(23 206 74 9 753 90)、(5 659 23 2 847 99)ngml1，差异有统计学意义。(4)PP 24 h 抑菌作用强弱与 PF4 含量无关，差异无统计学意义(P 0 05)。结论:PPP、PP 及 PGS 对大肠埃希菌均有抑菌作用，但有时效性，PPP与 PP 抑菌效果一致，均优于 PGS。同体积 PP 中 PF4 含量高于 PGS，PPP 中 PF4 含量最低，但 PP 在24 h的抑菌作用强弱与 PF4 含量无关。关键词富血小板血浆;抑菌作用;抗菌肽血小板因子 4 中图分类号457 14 文献标志码A 文章编号1671-6264(2023)01-0139-05931doi:10 3969/j issn 1671-6264 2023 01 020富血小板血浆(platelet-rich in plasma，PP)是从血液中分离得到的含高浓度血小板的血浆，而血浆离心后上层含少量血小板的部分即贫血小板血浆(plate-let poor plasma，PPP)。血小板凝胶是在 PP 中加入葡萄糖酸钙、凝血酶混合凝固所形成的胶状物，凝胶离心后取上层液体称为血小板凝胶上清液(platelet gel su-pernatant，PGS)。PP 及其衍生物均富含多类多种活性蛋白生长因子和细胞因子，能促进细胞增殖、组织修复。血小板活化后还会释放出抗菌肽，抗菌肽对多种细菌都具有抑菌作用，PP 在体内体外都具有一定的抗菌活性1-3。近年来国内外开展了一系列关于 PP的基础研究，包括 PP 中白细胞的影响、生长因子浓度、制备 PP 的离心速度等3-5。而 PP 与 PPP、PGS中抗菌肽等活性物质的差异研究较少，血小板因子 4(platelet factor 4，PF4)属于抗菌肽的 1 种。利用 PP及其衍生物的抑菌特性，临床上将它们通过注射或制成凝胶制剂应用到伤口上，作为抗生素治疗之外的替代治疗方法。大肠埃希菌是伤口感染的常见细菌6，本研究探讨 PPP、PP 及 PGS 对该菌的体外抑菌作用及其与 PF4 含量的关系，拟为 PP 及其衍生物治疗伤口感染的临床实践和其他研究提供依据。1材料与方法1 1实验材料数显水浴恒温振荡器(SHZ-82A，常州市金坛科兴仪器厂)，数显电热恒温培养箱(上海三发科学仪器有限公司)，Densicheck Plus 麦氏浊度仪(法国生物梅里埃公司)，血常规仪(日本希森美康公司)，WellscanK3酶标仪(芬兰雷勃公司)。哥伦比亚血培养基(上海科玛嘉微生物技术有限公司)，营养肉汤培养基为本室自制，一次性使用接种环(浙江拱东医疗器械股份有限公司)。PF4 试剂(#1210210252)(96 well-kit，美国ay-Bio 公司)。标准大肠埃希菌质控菌株(ATCC25922)由法国生物梅里埃公司赠送。1 2PPP、PP 及 PGS 的制备以 27 份本市中心血站健康志愿者捐献的单采血小板作为研究样本，其中男 23 例，女 4 例，平均年龄(37 0 10 8)岁。每份样本分 3 部分:一份经离心机以 10 000 g 离心 5 min，取上清即为 PPP;另一份作为PP;第三份与激活剂(凝血酶粉末按 100 Uml1溶于葡萄糖酸钙)以 10 1 均匀混合后于 37 水浴30 min，再以 2 220 g 离心 20 min 后取其上清即为 PGS。1 3PPP、PP 及 PGS 抑菌实验麦氏浊度仪调整大肠埃希菌悬液为 0 5 麦氏比浊度(1 5 108CFUml1)，分别设置 PPP 组、PP 组、PGS 组及生理盐水对照组，分别依次取 900 l PPP、PP、PGS、生理盐水于无菌 EP 管中，向每管加入100 l 0 5 麦氏比浊度的大肠埃希菌悬液，再加入500 l肉汤培养基(大肠埃希菌终浓度为 107CFUml1)。EP 管置 37 电热恒温培养箱中培养，于 0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 取出25 l 菌液，无菌生理盐水稀释200 倍后，取50 l 用一次性无菌接种环接种培养皿。随后将培养皿放于 37 电热恒温箱中培养16 24 h 后取出观察，并计数菌落数，绘制时间 菌落计数曲线图。1 4凝胶缓释液抑菌实验PGS 吸出取尽后留下凝胶，在凝胶中加入 1 ml 生理盐水，37 静置6 h 后吸出上清即为凝胶缓释液，将缓释液与细菌共培养一定时间后，采用无菌生理盐水稀释 600 倍，再同样取 50 l 涂布平板，37 培养一段时间后观察细菌生长情况。1 5抑菌率计算抑菌率=(对照样本平均菌落数 实验样本平均菌落数)/对照样本平均菌落数 100%。1 6ELISA 检测 PF4 含量27 例 PPP、PP 及 PGS 样本除抑菌实验外均留样于 40 冻存，一次性解冻后同时采用 ELISA 检测各组的 PF4 水平。1 7统计学处理采用 SPSS 25 0 统计软件进行数据分析。计量资料以均数 标准差表示，两组比较用 t 检验，多组比较采用方差分析;重复测量资料采用重复测量方差分析，使用 Lower-bound 法进行校正，当交互作用有统计学意义时进一步行简单效应分析。P 0 05 为差异具有统计学意义。2结果2 1PPP、PP 及 PGS 中血小板及白细胞的计数27 例 PPP 中血小板计数为(40 20)109L1，PP 中血小板计数为(903 93 158 30)109L1，PPP 及 PP 白细胞计数 1 1012L1，红细胞计数 1 109L1，PGS 中血小板计数为 0。041东南大学学报(医学版)2023 年 2 月，42(1)2 2各组抑菌情况27 例 PPP 与 PP 24 h 内抑菌效果基本一致，在18 h 内发挥较强抑菌作用，3 9 h 内完全无菌生长，随后抑菌作用减弱直至消失。PPP 与 PP 都存在差异，13 例在24 h 时抑菌作用仍较强，7 例24 h 时抑菌作用较弱，7 例 24 h 时无抑菌作用。而 PGS 抑菌效果相对较弱，在 9 h 内有抑菌作用，3 h 时抑菌作用最佳，随后抑菌作用逐渐减弱，12 h 时完全无抑菌作用。PGS 也存在差异，9 h 时无抑菌作用的共 5 例，18 例 9 h 仍有较弱的抑菌作用。PPP、PP 抑菌效果优于 PGS。见图1、2。图 1各组不同时间点菌落计数图 2各组不同时间抑菌情况2 3各组不同作用时间的抑菌率不同组别、不同作用时间下抑菌率的比较采用重复测量方差分析，各组不同时间点测得抑菌率