柑橘内生真菌LJZ-Y-11次生代谢产物抑菌活性研究_李奇聪.pdf

第 41 卷 第 1 期2023 年 1 月 广西师范大学学报(自然科学版)Journal of Guangxi Normal University(Natural Science Edition)Vol.41 No.1Jan.2023DOI:10.16088/j.issn.1001-6600.2021102801http:李奇聪,陈洁萍,欧艳绍,等.柑橘内生真菌 LJZ-Y-11 次生代谢产物抑菌活性研究J.广西师范大学学报(自然科学版),2023,41(1):155-163.LI Q C,CHEN J P,OU Y S,et al.Antimicrobial activity of the secondary metabolites from citrus endophytic fungus Nemania sp.LJZ-Y-11J.Journal of Guangxi Normal University(Natural Science Edition),2023,41(1):155-163.?柑橘内生真菌 LJZ-Y-11 次生代谢产物抑菌活性研究李奇聪1,2,3,4,陈洁萍1,2,3,4,欧艳绍1,2,3,4,杨树贤1,2,3,4,邓志勇1,2,3,4,骆海玉1,2,3,4,邓业成1,2,3,4(1.珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室(广西师范大学),广西 桂林 541006;2.广西漓江流域景观资源保育与可持续利用重点实验室(广西师范大学),广西 桂林 541006;3.广西珍稀濒危动物生态学重点实验室(广西师范大学),广西 桂林 541006;4.广西师范大学 可持续发展创新研究院,广西 桂林 541006)摘 要:本文选取柑橘内生真菌 Nemania sp.LJZ-Y-11 进行发酵培养,提取制备其乙酸乙酯提取物并测定抑菌活性,旨在为其开发利用奠定基础。结果表明,其乙酸乙酯提取物对 9 种植物病原真菌和 10 种动物病原菌均具有显著抑制作用。处理浓度为 2.5 g/L 时,对 9 种植物病原真菌的抑制活性均超过 50%,除对贡柑链格孢菌的抑制率为 56.52%外,对其余8 种病原菌的抑菌率均为 100%,EC50值在 0.004 80.154 4 g/L。其中,对玉米大斑病菌、金橘砂皮病菌和烟草黑胫病菌抑菌活性最为显著,EC50值分别为 0.004 8、0.005 3 和 0.006 7 g/L,均小于 0.01 g/L;其次为辣椒炭疽病菌、茶轮斑病菌和甘蔗凤梨病菌,EC50值分别为 0.022 7、0.035 6 和 0.067 9 g/L,均小于 0.1 g/L;对甘蓝黑斑病菌和水稻胡麻叶斑病菌也有较好的抑制活性,EC50值分别为 0.101 3 和 0.154 4 g/L。对 10 种动物病原菌均具有不同程度的抑制效果,MIC 值为0.078 12.500 0 g/L。其中,对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、炭疽杆菌、白色念珠菌具有较强的抑菌活性,MIC 值均小于 0.2 g/L,其中对枯草芽孢杆菌的抑菌活性最强,MIC 值为 0.078 1 g/L;对巨大芽孢杆菌和溶壁微球菌也有较好的抑菌活性,MIC 值均为 0.625 g/L;对产气肠杆菌和伤寒沙门氏菌的抑制活性相对较弱,MIC 值仅为 2.5 g/L。本文报道的柑橘内生真菌 Nemania sp.LJZ-Y-11 代谢产物具有广谱、显著抑菌活性,研究结果可为其次生代谢产物作为生物源抗菌剂开发利用提供依据。关键词:柑橘内生真菌;Nemania sp.;乙酸乙酯提取物;抑菌活性中图分类号:TQ455;S43 文献标志码:A 文章编号:1001-6600(2023)01-0155-09传统化学药剂的长期滥用带来农药残留、环境污染、毒性累积及耐药性种群数量增加等多种问题,因此人们持续关注低毒、高效活性天然产物的开发与利用。植物内生真菌作为一类重要的微生物,因其独特的生长代谢机制,已成为天然产物开发与利用的一类重要微生物资源1-2。植物内生真菌是指在生活史的某一阶段或全部阶段内,寄生在健康植物组织中且对宿主植物组织不引起明显病害症状的真菌3。其在植物中普遍存在,不仅可以促进宿主植物吸收养分,还可以提高植物对生物胁迫(病害、虫害等)和非生物胁迫(强光、干旱、高温或低温等)的抵抗能力4,刺激植物产生不同作用效果的活性物质5。这些活性物质涵盖生物碱、甾体、萜类、异香豆素、醌类、黄酮和木脂素等,具有较强的抑菌活性6、杀虫活性7、拒食活性8、抗氧化活性9、抗肿瘤活性9和细胞毒活性10,在植物病虫害防治和生物农药开发上有广阔的发展前景11。同时,植物内生真菌作为一类重要的微生物资源,具有生长繁殖快、易培养、易控制、发酵成本低和产量高等特点,且不受季节、气候、地域等自然条件的限制,易于通过现代生物技术改造遗传性状,通过植物内生真菌的发酵培养生产活性物质,具有良好应用收稿日期:2021-10-28 修回日期:2021-12-04基金项目:广西自然科学基金(2018GXNSFAA281013);广西重点研发计划(桂科 AB21196065);广西创新驱动发展专项(桂科 AA20161002-1);桂林市科学研究与技术开发计划(20190205);广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室主任基金(ERESEP2021Z05)通信作者:骆海玉(1985),女,广西桂林人,广西师范大学讲师,博士。E-mail:邓业成(1965),男,广西全州人,广西师范大学教授,博士。E-mail:广西师范大学学报(自然科学版),2023,41(1)潜力12-13。目前国内外已有研究表明,柑橘中含有极其丰富的内生真菌资源,初步的拮抗活性研究发现其具有抗细菌和抗真菌活性14-26。此外,对柑橘内生真菌次生代谢产物抑菌活性的研究已有少量报道。例如:郭东升等27利用柑橘内生燕麦镰刀菌 Fusarium avenaceum Gds-1 无菌发酵液防治柑橘青霉病,具有高效稳定的防治效果,与同浓度的抑霉唑防治效果相当;Pena 等25发现柑橘内生真菌 Muscodor sp.LGMF1254 产生的挥发性物质对柑橘黑斑病原菌菌丝和孢子具有显著抑制活性,能有效控制离体叶片组织病斑形成。笔者所在研究小组前期研究发现,供试的大部分柑橘内生真菌乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌具有显著抑制活性28。柑橘中含有十分丰富的内生真菌,其中可能含有丰富的抑菌活性菌株及次生代谢产物,是一个潜力巨大、亟待研究开发的资源宝库。本研究对前期筛选得到的具有抑菌活性的内生真菌 Nemania sp.LJZ-Y-11进行发酵培养,制备其发酵提取物,并测定发酵提取物的抑菌活性,以期为该菌株次生代谢产物作为生物源抗菌剂的开发利用提供依据。1 材料与方法1.1 柑橘内生真菌供试柑橘内生真菌 LJZ-Y-11 由广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室化学生态实验室提供,鉴定为 Nemania sp.,GenBank 序列号为 MK35145528。1.2 供试植物病原真菌9 种供试植物病原真菌详见表 1。表 1 9 种供试植物病原真菌Tab.1 Nine species of plant pathogenic fungi for testing植物病原真菌来源辣椒炭疽病菌 Colletotrichum capsici广西大学农学院植物病理室茶轮斑病菌 Pestalotiopsis theae广西大学农学院植物病理室贡柑链格孢菌 Alternaria citri广西特色作物研究院烟草黑胫病菌 Phytophthora parasitica var.nicotianae广西大学农学院植物病理室金橘砂皮病菌 Diaporthe citri广西特色作物研究院甘蔗凤梨病菌 Ceratocystis paradoxa广西大学农学院植物病理室甘蓝黑斑病菌 Alternaria oleracea广西大学农学院植物病理室玉米大斑病菌 Exserohilum turcicum广西大学农学院植物病理室水稻胡麻叶斑病菌 Cochliobolus miyabeanus广西大学农学院植物病理室1.3 供试动物病原菌10 种供试动物病原菌详见表 2。1.4 内生真菌的发酵培养将活化的柑橘内生真菌 LJZ-Y-11 接种至无菌大米固体培养基(米和水的质量体积比为 1 1,50 g 大米/500 mL 培养瓶)中,26 恒温培养 60 d。1.5 发酵提取物的制备将1.4 节中的培养物取出并处理成小块,60 烘干后,用2 倍体积量的乙酸乙酯浸泡提取,7 d 后真空抽滤,重复 3 次,合并滤液,旋转蒸发浓缩蒸干,得到 LJZ-Y-11 乙酸乙酯提取物,置于 4 冰箱中保存备用。651http:表 2 10 种供试动物病原菌Tab.2 Ten species of animal pathogenic bacteria for testing动物病原菌来源枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis桂林医学院微生物实验室巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium桂林医学院微生物实验室大肠杆菌 Escherichia coli桂林医学院微生物实验室溶壁微球菌 Micrococcus lysodeikticus桂林医学院微生物实验室金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus桂林医学院微生物实验室产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes桂林医学院微生物实验室蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus桂林医学院微生物实验室伤寒沙门氏菌 Salmonella typhi桂林医学院微生物实验室炭疽杆菌 Bacillus anthraci桂林医学院微生物实验室白色念珠菌 Monilia albican桂林医学院微生物实验室1.6 对植物病原真菌抑制活性的测定参照 Luo 等29的方法,采用菌丝生长速率法进行测定。具体操作如下:在无菌超净工作台中,用丙酮溶解 LJZ-Y-11 乙酸乙酯提取物,配制成 25 g/L 药液。将药液与热熔并冷却至 50 左右的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基按体积比1 9 混合均匀(药液终浓度为2.5 g/L,对照组用丙酮替代药液),倒入直径为9 cm 的培养皿中,待冷却凝固后使用。取活化好的病原菌,在其菌落边缘用打孔器打取直径为 4 mm 的菌饼,用接种针挑取菌饼接于上述培养基平板中,菌丝面朝下,每个浓度设置 3 个重复。26 暗培养 72 h,采用十字交叉法测量病原菌菌落的直径,并计算抑菌率,抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.4 cm)100%。测定有效中浓度时,以丙酮为溶剂配制 2.5 g/L 母液,进行 2 倍稀释,配制 5 个以上系列浓度的药液,测定各个浓度的抑菌率,用最小二乘法求出毒力回归方程、相关系数 r、有效中浓度 EC50及 EC50的 95%置信限。1.7 对动物病原菌抑制活性的测定参照文献30的方法,采用带药平板涂布法测定 LJZ-Y-11 乙酸乙酯提取物对 10 种动物病原菌的抑制活性。具体操作如下:在无菌超净工作台中,用丙酮作为溶剂,将 LJZ-Y-11 乙酸乙酯提取物溶解,配制成 5 g/L 药液,将药液与热熔并冷却至 50 左右的牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基按体积比 1 9 混合均匀(药液终浓度为 0.5 g/L,对照组以丙酮代替药液),倒入直径为 4.5 cm 的培养基中,冷却凝固后使用。用 15 mL 西林瓶制备供试病菌悬液,用接种环从培养基上刮取适量的动物病原菌与 8 mL 无菌水混合均匀,吸取 50 L 加到上述待用培养皿中,用涂布棒涂布均匀,每处理 3 个重复,28 培养 24 h 后观察并记录细菌生长状况,“-”代表无菌生长,“+”代表有菌生长。针对未长菌的菌种继续测定 LJZ-Y-11 乙酸乙酯提取物对其最低抑制浓度(MIC),按照以上方法配制成一系列浓度梯度药液,不长菌的最低浓度