甘麦大枣汤对PTSD模型大鼠行为学的影响及其机制研究_张金.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 国家自然科学基金项目（）；安徽省重点研究和开发计划项目（）；中国科学院心理研究所自主部署课题（）通信作者郭建友，博士，研究员，研究方向为中医药防治抑郁、焦虑的心理疾患药理等，：作者简介 张金，硕士研究生，工程师，研究方向为中医药防治抑郁、焦虑等，：甘麦大枣汤对 模型大鼠行为学的影响及其机制研究张金，董健健，朱清俊，郑艳敏，童海洋，吴云，王璐璐，杨鸿毅，郭建友，（中国科学院 心理研究所，北京；中国科学院大学 心理学系，北京；中国科学院合肥物质科学研究院，安徽 合肥；安徽中医药大学 神经病学研究所，安徽 合肥）摘要 探讨甘麦大枣汤对创伤后应激障碍（，）模型大鼠行为学的影响，通过磁共振成像和蛋白表达的变化研究相关机制。将 只大鼠随机分为 组，正常组、模型组、阳性对照组（氟西汀，灌胃给药，.）以及甘麦大枣汤低（）、中（）、高（）剂量组，每组 只。单次延长应激（，）建立 模型后 周，阳性对照组给予盐酸氟西汀胶囊灌胃，低、中、高剂量组给予甘麦大枣汤的不同剂量灌胃，正常组和模型组给予同等体积的生理盐水灌胃，连续给药 。旷场实验、十字高架迷宫、强迫游泳实验和新物体识别实验进行行为学测试；每组分别选择 只大鼠用蛋白质印迹法（）检测海马区神经肽受体（）蛋白表达量；再将每组的另外 只大鼠用.磁共振成像实验观测脑区的整体结构变化以及海马区的各向异性分数。旷场实验结果显示，模型组大鼠总路程及中央路程较正常组显著降低，甘麦大枣汤中、高剂量组大鼠总路程及中央路程较模型大鼠显著增加；高架十字迷宫检测发现中、高剂量甘麦大枣汤可显著增加 模型大鼠开臂进入次数及开臂停留时间；强迫游泳实验发现，模型组大鼠在水中不动时间显著高于正常组，甘麦大枣汤可显著降低 模型大鼠水中不动时间；新物体识别测试发现，甘麦大枣汤可显著增加 模型大鼠对新物体的探索时间；结果显示，甘麦大枣汤可显著降低 模型大鼠海马 蛋白表达；.磁共振检测发现，各组在结构像上无显著差异，而在功能像上，模型组海马体各向异性分数（值）显著低于正常组，甘麦大枣汤中、高剂量组大鼠海马区 值较 模型大鼠显著增加。甘麦大枣汤可通过抑制 模型大鼠海马 表达，减轻海马神经元损伤，从而改善 模型大鼠神经功能损伤，发挥神经保护作用。关键词 甘麦大枣汤；创伤后应激障碍；神经功能损伤；行为学；.磁共振；神经保护作用 ，（，；，；，；，）（）张金等：甘麦大枣汤对 模型大鼠行为学的影响及其机制研究 ，（），（），（），（.），（），（），.，.，（），；.；：.创伤后应激障碍（，）是个体暴露于异乎寻常的威胁性或灾难性应激事件（如自然灾害、战争、严重的事故、目睹他人死亡、成为恐怖活动、强奸或其他犯罪活动的受害者或目击者）后，出现的一种持续且严重的心理疾患。作为一种复杂的心理疾患，会对患者的心理产生严重的影响，导致患者遭受精神痛苦，产生功能障碍，并降低患者的生活质量。在医护人员、退伍军人、大学生、灾害幸存者和其他有创伤经历的成年人群体以及经历大爆炸和高强度地震的群体等都是可能的 心理疾患者，相关问题是迫切需要展开系统而深入的基础与应用研究。甘麦大枣汤出自汉代张仲景金匮要略，具有养心安神、和中缓急功效，主要用于改善睡眠，近年来其抗抑郁功效逐渐被重视，临床常使用甘麦大枣汤治疗各类精神疾病，如焦虑和抑郁，疗效 明显。本研究进行甘麦大枣汤对创伤后应激障碍的治疗作用及其机制研究，以期为临床应用提供实验依据。材料与方法.动物 大鼠 只，雌性，周龄，体质量 ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号（京）。实验在磁共振成像安徽省重点实验室进行，许可证号（皖），大鼠购入后先适应性喂养 ，实验期间大鼠均在室温（）、相对湿度、照明系统自动控制 明暗循环（亮灯：，熄灯：次日：）的环境中，分笼饲养，每笼 只。本实验遵循实验动物“原则”。.药物甘麦大枣汤原料药购自北京同仁堂，小麦、甘草 年 月第 卷第 期.，.，和大枣按照 混合，然后将混合物制成粉末，加水后，在蒸馏器中煮沸（），回流，萃取完成后，在低于 的减压状态下，过滤并进行干燥，制成冻干粉。氟西汀胶囊购自礼来苏州制药有限公司，批号。.试剂与仪器 裂解液（批号，）；（批号，）；磷酸化蛋白酶抑制剂（批号，）；蛋白定量检测试剂盒（批号，）；蛋白还原型上样缓冲液（批号 ，）；凝 胶 制 备 试 剂 盒（批 号，）；显 影 定 影 试 剂（批 号，）。高架十字迷宫（，上海欣软信息技术有限公司）；旷场实验装置（，上海欣软信息技术有限公司）；强迫游泳实验装置（，上海欣软信息技术有限公司）；新物体识别测试装置（，上海欣软信息技术有限公司）；色谱仪（，）；质谱仪（，）；高 场 磁 共 振 成 像 装 置（.，）；磁共振影像采集系统（，布 鲁 克）；超 导 磁 体（.口径，安捷伦）；梯度线圈（口径嵌入式，）；自制正交收发一体射频表面线圈（专利号.）；动物饲养 笼具（笼一拖二，苏州市冯氏实验动物设备有限公司）；超净工作台（，苏州市冯氏实验动物设备有限公司）。.动物分组与造模大鼠适应性喂养 后，根据体质量将其随机分为 组，包括正常组、模型组、氟西汀组（阳性对照组）以及甘麦大枣汤低、中、高剂量组，每组 只。采 用 单 次 延 长 应 激（，）方法造模，除了正常组，其余各组大鼠通过固定器牢牢束缚固定 ，再将大鼠放入水中（水温在 左右）强迫其游泳，接着休息 后，通过异氟烷麻醉至翻正反射消失，每只造模后单独饲养 周。.动物给药造模后，阳性对照组使用氟西汀胶囊灌胃给药，剂量.；甘麦大枣汤低、中、高剂量组使用甘麦大枣汤冻干粉灌胃给药，剂量分别为、；正常组、模型组给予等体积的生理盐水灌胃。连续给药 。.液质分析取甘麦大枣汤低、中、高剂量的样本 ，加入 甲醇 ，涡旋 ，离心，取上清过滤后上机分析。高分辨液质采集的数据通过 .（）完成数据初步整理后进行数据库检索比对（），匹配对应化合物。.行为学检测.旷场实验于测试前 将待测大鼠放入测试房间适应环境，测试开始后，关闭房间灯光，将大鼠置于底面为 的黑色敞箱中，待其自由活动 后，记录大鼠 内在旷场活动中的总路程和中央路程。.高架十字迷宫实验于测试前 将待测大鼠放入测试房间适应环境，测试开始后，关闭房间灯光，记录大鼠 内在高架十字迷宫里分别进入开臂的次数（，）和在开臂的时间（，）。.强迫游泳实验将大鼠放入水深 、直径 、高 的玻璃缸中，水温（），大鼠后肢不能触及缸底，前肢不能附于缸壁顶部。为避免强光噪音的干扰，水缸周围围有黑色纸箱遮挡。实验共观察 ，适应 ，记录后 内大鼠累计静止时间。大鼠游泳结束及时用吹风机处理干燥，并严格控制水温，每只大鼠实验前更换实验用水。.新物体识别测试实验将大鼠放入黑色聚酯塑料材质构成的封闭箱，实验箱体积为 。顶部采用摄像头观察动物的活动情况及探索过程。实验过程分为 个阶段：适应期、熟悉期、测试期。适应期 ，每天将动物依次放入实验箱内，熟悉环境 。适应期结束后，次日进行熟悉和测试。熟悉期时，将 个完全相同的物体放入实验箱内对称的位置处，距离侧箱壁、箱后壁的距离均为 ；记录大鼠 内对 个物体的探索总时间。间隔 后，进入测试期。测试期内，将其中一个熟悉物体换为另一个大小相近但形状和颜色不同的新颖物体，记录大鼠对新颖物体和熟悉物体的探索时间。并用辨别指数（张金等：甘麦大枣汤对 模型大鼠行为学的影响及其机制研究，）来评价动物的学习记忆能力。（）（），其中 为新颖物体探索时间，为熟悉物体探索时间。.蛋白印迹法分析大鼠海马组织用冷 洗涤 次，去除血污，剪成小块置于匀浆管中。加入 个 的小磁珠，加入 倍组织体积的试剂置于均质匀浆机中，选择程序彻底匀浆，收集上清，即为总蛋白溶液。用 蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。以 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白转移到 膜上。用含 脱脂奶粉的 封闭液 摇床孵育过夜，于摇床洗涤，一抗抗体常温摇床孵育 ，缓冲液洗涤，将 膜与二抗（）在室温摇床孵育.。使用 化学发光试剂盒进行曝光，运用 软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值作为该蛋白的表达量。.核磁共振成像实验分别对 组大鼠（每组 只）采集了 加权像、加权像及扩散张量成像（，）。其中 加权像采用 序列，；加权像采用 序列，、与 加权像一致，观察大鼠脑区的结构变化；扩散张量成像技术采用 序列，、与 加权像一致，采用 抑制脑外区域，所有序列采用 ，将海马部分区域作为感兴趣区（，），计算区域内各量化指标均值用以统计分析。为大小、位置相同的椭圆形，为减小手绘误差，将 保存为模板以做标记，并选取双侧数据均值作为各 的测量值（值）。.统计分析采用 .软件进行统计学分析，数据用均数标准误差（?）表示。组间采用独立样本 检验分析统计学上是否存在显著性差异。.认为差异具有统计学意义。结果.甘麦大枣汤液质定性分析液质定性分析结果显示，甘麦大枣汤低剂量样本在 中共匹配到 个化合物，中 个化合物综合评分大于 分；中剂量样本在 中共匹配到 个化合物，中 个化合物综合评分大于 分；高剂量样本在 中共匹配到 个化合物，中 个化合物综合评分大于 分，形成质谱数据，将峰值较高的化合物进行了标注，见图。并列出了相关度高的化合物名称，按照黄酮、酚类、生物碱、皂苷进行分类，见表。.甘麦大枣汤对 大鼠行为学的影响.旷场实验 旷场实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠总路程和中央路程显著缩短（.）；与模型组比较，甘麦大枣汤中、高剂量组和氟西汀组大鼠总路程和中央路程显著回升（.，.），见表。.高架十字迷宫实验高架十字迷宫实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠 与 显著降低（.，.）；与模型组比较，甘麦大枣汤中、高剂量组和氟西汀组大鼠 与 显著增加（.，.），见图、表。.强迫游泳实验 强迫游泳实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠在水中不动时间显著延长（.）；与模型组比较，甘麦大枣汤中、高剂量组和氟西汀组大鼠不动时间显著缩短（.，.），见表。.新物体识别测试实验新物体的探测时间方面，模型组与正常组相比显著降低（.）；与模型组相比，甘麦大枣汤中、高剂量组和氟西汀组新物体的探测时间显著增加（.，.），见表。根据鉴别指数（）可以看出，甘麦大枣汤中、高剂量组和氟西汀组显著高于模型组（.），而模型组和甘麦大枣汤低剂量组 数值较小且为负值，见图。结果表明，甘麦大枣汤中、高剂量组和氟西汀组与模型组相比新物体探索时间大于熟悉物体探索时间，模型组和甘麦大枣汤低剂量组的熟悉物体与新物体探索时间基本相同。.甘麦大枣汤对 大鼠蛋白表达的影响结果显示，与正常组比较，模型组大鼠海马 年 月第 卷第 期.，.，低剂量样品；中剂量样品；高剂量样品；左图为负离子模式，右图为正离子模式。图 甘麦大枣汤样品中天然产物鉴定的总离子流图 表 甘麦大枣汤样品匹配的化合物 样品 分子式 相对分子质量化合物分类低剂量.生物碱.黄酮.皂苷.酚.酚中剂量.皂苷.酚.黄酮.酚.皂苷高剂量.酚.生物碱.生物碱.黄酮.酚表 甘麦大枣汤对 大鼠行为学的影响（?，）（?，）组别剂量 旷场实验高架十字迷宫实验强迫游泳实验新物体识别测试实验总路程 中央路程 次 水中不动时间 熟悉时间 探测时间 正常.模型.）.）.）.）.）.）甘麦大枣汤.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）氟西汀.）.）.）.）.）.）注：与正常组相比）.，）.；与模型组相比）.，）.。张金等：甘麦大枣汤对 模型大鼠行为学的影响及其机制研究低、中、高剂量组为甘麦大枣汤给药（图 同）。红色方框为开臂区域；绿色方框为闭臂区域。图 大鼠在高架十字迷宫中的运动轨迹 与模型组相比.。图 根据大鼠对新颖物体和熟悉物体的探索时间计算出的鉴别指数（?，）（?，）蛋白表达显著增加（.）；与模型组比较，甘麦大枣汤中、高剂量组和氟西汀组处理可显著降低 大鼠 蛋白表达（.，.），见图。.甘麦大枣汤对 大鼠脑结构和功能的影响 结构成像异常主要表现为基底节、丘脑、小脑、脑干的长、长 信号。本实验采用.磁共振成像系统采集大鼠颅脑、图像，结果显示，各组大鼠的脑部结构像数据中，各区域内均