改良快速骨组织脱钙法在透射电镜样品制备中的应用_王立言.pdf

改良快速骨组织脱钙法在透射电镜样品制备中的应用王立言，邴馨，刘尚明*，王辉，陈艳雯（山东大学基础医学院实验核医学与电镜中心，济南 250012）摘要目的 探讨改良快速骨组织脱钙法在透射电镜样品制备中的应用效果。方法 使用 JYBL-组织脱钙液，加入电镜专用戊二醛固定液，并对渗透压等影响因素进行了有效控制，与传统脱钙法处理电镜样品后进行比较。结果 改良快速骨组织脱钙法使脱钙时间由传统的 24 周缩短至 24 h，电镜观察骨组织超微结构完整性更好，结构更清晰。结论 改良快速骨组织脱钙法在透射电镜样品制备中具有较高的应用价值，值得推广。关键词脱钙；骨组织；透射电镜中图分类号R34 文献标识码A DOI：10.16705/ki.1004-1850.2022.06.011Application of improved rapid bone decalcification in preparation of transmission elec-tron microscopy samplesWang Liyan,Bing Xin,Liu Shangming*,Wang Hui,Chen Yanwen(Center for Experimental Nuclear medicine and Electron Microscope,School of Basic Medical Sciences,Shandong University,Jinan 250012,China)AbstractObjective To investigate the application of improved rapid bone decalcification method in the sample preparation of transmission electron microscopy.Methods The improved method used JYBL-tissue decalcification solution and added glutaralde-hyde fixative solution for electron microscope.The influence factors such as osmotic pressure were effectively controlled.The results were compared with those of traditional decalcification method.Results The improved rapid bone decalcification method shortened the decalcification time from the traditional 2-4 weeks to 24 hours,and the ultrastructure of bone tissue is more complete and clearer under electron microscopy.Conclusion The improved method of rapid bone decalcification has important application value in TEM sample preparation.KeywordsDecalcification;bone tissue;transmission electron microscope中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 31 卷第 6 期2022 年 12 月Vol.31.No.6December.2022收稿日期2022-09-05 修回日期2022-12-08基金项目山东大学实验室建设与研究管理重大项目(SY20211401)；山东大学实验室建设与管理研究项目（sy20223404）作者简介王立言，男（1975 年），汉族，实验师*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：脱钙是制备骨组织透射电镜样品的第一步。然而，如何缩短脱钙时间，把握脱钙终点，减少脱钙过程中对组织的损伤，尽可能保持骨组织原有的微细结构，一直是研究人员密切关注的问题。传统的脱钙方法一般采用复合酸类脱钙液，其效果不稳定，对细胞及组织结构的破坏及对染色的影响，已不能满足透射电镜观察的要求1,2；EDTA 脱钙的作用优于酸性脱钙液，但脱钙周期长，一般需要 2-4 周，不利于科研实验的进展。本方法通过大量实验，采用JYBL-组织脱钙液并在此基础上进行了改进，对骨组织脱钙后进行透射电镜样品制备，在电镜下观察取得良好效果，同时很大程度的降低了脱钙时间。材料与方法1 标本取小鼠新鲜股骨组织，大小为 1 mm1 mm3 mm。2 试剂改进的脱钙液为 Leagene JYBL 脱钙液、戊二醛及磷酸缓冲液按一定比例配制而成的混合液。具王立言等.改良快速骨组织脱钙法在透射电镜样品制备中的应用第 6 期 609体配制方法如下：100 mL Leagene JYBL-脱钙液（北京雷根生物技术有限公司）、20 mL 25%戊二醛（SPI，美国）、40 ml 0.2 mol/L，pH7.4 磷酸缓冲液混合均匀，4 冰箱保存。3 实验方法传统脱钙方法：将取好的骨组织入预冷的3%戊二醛中，4 下固定 24 h 或更长。骨组织固定好后入缓冲、等渗、中性 EDTA 脱钙液中，4 下振荡脱钙 24 周。改良脱钙方法：将取好的骨组织立刻投入到3戊二醛与 4多聚甲醛的混合液中，4 固定 12 h；0.1 mol/L、pH7.4 磷酸缓冲液浸洗 1 h（04）；弃去缓冲液，在小瓶中加入改进脱钙液对骨组织进行脱钙（4）。脱钙液要没过骨组织，约为骨组织体积的 40 倍；脱钙时间控制在 24 h 以内：每隔一段时间检测一次脱钙程度，在骨组织富有弹性、针刺无阻力感时即可终止脱钙。在保证超薄切片质量情况下，应尽量缩短脱钙时间，避免脱钙时间过长和反复针刺检测造成组织损伤。两种方法脱钙结束后，均行常规透射电镜样品制备过程：0.1 mol/L、pH7.4磷酸缓冲液浸洗3 h，中间换液 3 次（0 4）；1锇酸中后固定 2 h（0 4）；0.1 mol/L、pH7.4 磷酸缓冲液浸洗 3 h，中间换液 3 次；依次在 30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮中梯度脱水，每次 15 min，其中 100%丙酮脱水 2 次；在纯丙酮 Epon 812 包埋剂为 3 1、1 1 和 1 3 的混合浸透液中分别浸透 1 h、3 h 和12 h 后，在纯包埋剂中浸透 12 h；用纯包埋剂再包埋模具中包埋；37 和 45 各聚合 2 h 后，60 聚合 48 h；超薄切片机（剑桥，英国）切片、醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后行透射电镜（JEM-1200EX，日本电子）观察3。结 果透射电镜观察显示：用传统方法脱钙处理的样品其切片质量较差，骨细胞突起减少，胶原纤维、细胞核及细胞器均不清晰，骨细胞超微结构破坏较明显（图 1A）；而用改良脱钙方法处理的样品其切片质量更好，超微结构更完整，骨陷窝内骨细胞清晰可见，骨细胞表面的突起保存完好，细胞核及胞质内的细胞器结构完整清晰，基质中的胶原原纤维在纵切面上可见明显的周期性横纹（图 1B）。图 1 传统脱钙法（A）和改良脱钙法（B）对骨组织超微结构影响的透射电镜观察。N，细胞核；Mi，线粒体；Pr，突起；Co，胶原原纤维；比例尺，1 mFig.1 Transmission electron microscopic observation on the effect of traditional decalcification(A)and modified decalcification(B)on the ultrastruc-tures of bone tissue.N,nucleus;Mi,mitochondria;Pr,process;Co,collagen fibrils;scale bar,1 m讨 论骨组织由细胞、纤维和基质构成，其中含有大量的无机盐。无机盐的主要成分为以羟基磷灰石结晶形式存在的磷酸钙和碳酸钙4，约占骨干重的 70%。由于钙盐的沉积，骨组织非常坚硬。在透射电镜样品制备过程中，如果不去除骨组织的钙质，会给固定、脱水、浸透带来困难，也无法制作出有效的超中国组织化学与细胞化学杂志610第 31 卷薄切片。因此在样品制备前需要对骨组织进行有效脱钙，使钙盐溶解，使标本变软5，才能进行后续操作。目前的脱钙液有有机酸、无机酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等多种。用酸类脱钙时，脱钙速度快，但对骨组织破坏明显，因此不适合透射电镜样品的制备。EDTA 是一种相对较好的螯合脱钙剂，对组织结构影响较小，能保存组织中的抗原物质和某些酶的活性，但是 EDTA 脱钙操作复杂，脱钙时间长（24 周）。长时间的脱钙不利于脂类等物质的保存，也延长了实验周期6-8。经过大量的实践，我们改进了 JYBL-组织脱钙液，在脱钙液中加入专用的戊二醛电镜固定剂，同时对戊二醛的浓度、渗透压、pH 值等参数进行了精确调整，消除试剂间的相互作用，由此更适合于制备电镜样品9。该方法的特点是：作用迅速，24 h 即可完成脱钙；固定和脱钙同时进行，更利于微细结构的保存。脱钙完全。如果脱钙不完全，胶原原纤维上的无机盐结晶会使周期性横纹不可见。本研究结果表明，应用后改良快速骨组织脱钙法制备透射电镜样品，可有效防止骨组织过度膨胀和脱钙对骨组织的损伤，脱钙时间由传统的 24 周缩短至 24 h；骨组织超微结构保持完好，细胞及纤维形态结构清晰；脱钙液中的戊二醛可以较好的保存抗原活性10，脱钙后的骨组织可正常进行免疫组织化学和原位杂交组织化学染色；脱钙过程中无需更换脱钙液，操作简便，脱钙均匀，效果良好，在骨组织透射电镜样品制备中具有较高的应用价值。参 考 文 献1 翁丹枫，傅晓丹，陈淑惠，等.EDTA 脱钙在骨组织大切片制片中的应用效果J.临床与实验病理学杂志，2021，37（3）：350-351.2 Savi FM,Brierly GI,Baldwin J,Theodoropoulos C,Wood-ruff MA:Comparison of Different Decalcification Methods Using Rat Mandibles as a ModelJ.J Histochem Cytochem,2017,65(12):705-722.3 张保华，李伯勤，张向红，等.骨细胞超薄切片技术改进 J.山东大学学报(医学版)，2002，40（1）：91-914 罗灿峤，莫木琼，钟觉民.不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用 J.中国实用医药，2011，6（19）：27-28.5 Bogoevski K,Woloszyk A,Blackwood K,et al.Tissue Mor-phology and Antigenicity in Mouse and Rat Tibia:Compar-ing 12 Different Decalcification ConditionsJ.J Histochem Cytochem,2019,67(8):545-561.6 马恒辉，章如松，周航波，等.介绍一种改良的 Neutral氏 EDTA 脱钙液 J.诊断病理学杂志，2005，12（5）：391-391.7 赵雨坤，郑康，郭晴晴.一种基于 EDTA 脱钙法的改良骨组织脱钙方法 J.中国实验方剂学杂志，2016，22（11）：617-618.8 Ramirez T,Sacchini S,Paz Y,et al.Comparison of Methods for the Histological