动物医学进展,2023,44(2):1-7ProgressinVeterinaryMedicine研究论文非洲猪瘟病毒截短p54蛋白的原核表达与纯化收稿日期:2022-03-10基金项目:山东省重点研发计划项目(2020CXGC010801-02);山东省生猪产业技术体系项目(SDAIT-08-07)作者简介:伦玉潇(1997-),女,山东聊城人,硕士研究生,主要从事预防兽医学研究。*通讯作者伦玉潇1,李桂梅1,2,3*,单虎1,2,3(1.青岛农业大学动物医学院,山东青岛266109;2.山东省新兽药创制协同创新中心,山东青岛266109;3.山东省兽药诊断试剂工程技术研究中心,山东青岛266109)摘要:旨在高效表达可溶性的非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白。去除可能影响p54蛋白可溶性表达的前50个氨基酸(aa),根据GenBank收录的ASFVp54基因序列设计引物,从第51个aa对应的基因序列起用PCR扩增截短的p54基因,并用分子克隆方法插入到带有TF及His标签的冷休克表达载体pColdTF上,构建pColdTF-p54重组质粒。经菌液PCR及测序验证后将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达p54重组截短蛋白,对IPTG诱导浓度、诱导时间进行优化,并对纯化重组蛋白时所用洗脱液的咪唑浓度进行探索。Westernblot鉴定p54重组截短蛋白的反应原性,并探究TF标签对于该蛋白反应原性的影响。结果表明,成功构建了pColdTF-p54重组质粒,经终浓度为1mmol/L的IPTG于16℃诱导9h时,p54重组截短蛋白的表达量最高,分子质量约为76ku。经50mmol/L咪唑洗脱液洗脱可得到较纯的p54重组截短蛋白,经人鼻病毒(Humanrhinovirus,HRV)3CProtease切除TF及His标签后,再次纯化可得到无标签且高纯度的p54截短蛋白。Westernblot结果显示无标签的p54截短蛋白及有标签的p54重组截短蛋白均可被ASFVp54单克隆抗体特异性识别,均具有反应原性,且p54重组截短蛋白还可被ASFV阳性血清特异性识别。研究证实了原核表达的p54重组截短蛋白兼具可溶性、良好的反应原性,且重组蛋白上的TF标签不影响抗体对p54蛋白的识别,因此可用于后续ASFV抗体检测方法的研发。关键词:非洲猪瘟病毒;p54蛋白;pColdTF载体;原核表达;纯化中图分类号:S852.651文献标识码:A文章编号:1007-5038(2023)02-0001-07非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性、出血性传染病。目前尚无有效安全的ASF疫苗。ASFV双囊膜结构能适应多种不良环境,感染ASFV的猪可通过分泌物、排泄物等污染环境,健康猪接触被污染的环境可被感染[1]。自然条件下隐性感染ASFV的猪临...
