非洲猪瘟病毒截短p54蛋白的原核表达与纯化_伦玉潇.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):1-7P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e研究论文非洲猪瘟病毒截短p 5 4蛋白的原核表达与纯化 收稿日期:2 0 2 2-0 3-1 0 基金项目:山东省重点研发计划项目(2 0 2 0 C X G C 0 1 0 8 0 1-0 2);山东省生猪产业技术体系项目(S D A I T-0 8-0 7)作者简介:伦玉潇(1 9 9 7-),女,山东聊城人,硕士研究生,主要从事预防兽医学研究。*通讯作者伦玉潇1,李桂梅1,2,3*,单 虎1,2,3(1.青岛农业大学动物医学院,山东青岛2 6 6 1 0 9;2.山东省新兽药创制协同创新中心,山东青岛2 6 6 1 0 9;3.山东省兽药诊断试剂工程技术研究中心,山东青岛2 6 6 1 0 9)摘 要:旨在高效表达可溶性的非洲猪瘟病毒(A S F V)p 5 4蛋白。去除可能影响p 5 4蛋白可溶性表达的前5 0个氨基酸(a a),根据G e n B a n k收录的A S F Vp 5 4基因序列设计引物,从第5 1个a a对应的基因序列起用P C R扩增截短的p 5 4基因,并用分子克隆方法插入到带有T F及H i s标签的冷休克表达载体p C o l dT F上,构建p C o l dT F-p 5 4重组质粒。经菌液P C R及测序验证后将重组质粒转化到B L 2 1感受态细胞中,I P T G诱导表达p 5 4重组截短蛋白,对I P T G诱导浓度、诱导时间进行优化,并对纯化重组蛋白时所用洗脱液的咪唑浓度进行探索。W e s t e r nb l o t鉴定p 5 4重组截短蛋白的反应原性,并探究T F标签对于该蛋白反应原性的影响。结果表明,成功构建了p C o l dT F-p 5 4重组质粒,经终浓度为1mm o l/L的I P T G于1 6诱导9h时,p 5 4重组截短蛋白的表达量最高,分子质量约为7 6k u。经5 0mm o l/L咪唑洗脱液洗脱可得到较纯的p 5 4重组截短蛋白,经人鼻病毒(H u m a nr h i n o v i r u s,HR V)3 CP r o t e a s e切除T F及H i s标签后,再次纯化可得到无标签且高纯度的p 5 4截短蛋白。W e s t e r nb l o t结果显示无标签的p 5 4截短蛋白及有标签的p 5 4重组截短蛋白均可被A S F Vp 5 4单克隆抗体特异性识别,均具有反应原性,且p 5 4重组截短蛋白还可被A S F V阳性血清特异性识别。研究证实了原核表达的p 5 4重组截短蛋白兼具可溶性、良好的反应原性,且重组蛋白上的T F标签不影响抗体对p 5 4蛋白的识别,因此可用于后续A S F V抗体检测方法的研发。关键词:非洲猪瘟病毒;p 5 4蛋白;p C o l dT F载体;原核表达;纯化中图分类号:S 8 5 2.6 5 1文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 0 1-0 7 非洲猪瘟(A f r i c a ns w i n ef e v e r,A S F)是由非洲猪瘟病毒(A f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u s,A S F V)引起的猪的一种急性、高度接触性、出血性传染病。目前尚无有效安全的A S F疫苗。A S F V双囊膜结构能适应多种不良环境,感染A S F V的猪可通过分泌物、排泄物等污染环境,健康猪接触被污染的环境可被感染1。自然条件下隐性感染A S F V的猪临床症状不明显,只能从血液和组织中检测到A S F V,这种隐性感染可造成更大范围病原传播2。A S F V基因组可编码1 5 0个2 0 0个蛋白质,大多与病毒复制、组装、细胞凋亡、免疫功能、炎症反应等有关3。p 5 4是A S F V编码的主要结构蛋白之一,在病毒的吸附和侵入过程起重要作用,病毒进入机体后可产生针对该蛋白的抗体,抗体检测阳性即代表存在A S F V感染4。p 5 4蛋白有很强的保守性,是良好的A S F血清学诊断靶点5。p 5 4蛋白建立的 血 清 学 试 验 方 法 灵 敏 性 为9 8%,特 异 性 为9 7%6。健康猪的血清中不存在A S F V特异性抗体,通过特异性抗体检测可筛查出感染A S F V的猪。感染A S F V NH/P 6 8弱毒株后用E L I S A在感染早期即可检测到针对p 5 4蛋白的I g G抗体反应,在感染后1 4d 3 9d期间p 5 4抗体均维持在较高水平7。蓝思白2号(L S-2)猪在经过A S F V强毒攻击后约有8 0%存活,存活猪自感染的第1 2天起体内的p 5 4抗体水平较高,普通猪感染后1 0d内死亡且体内p 5 4抗体水平较低或阴性8。p 5 4抗体水平越高,代表机体产生的免疫性越强。因此,p 5 4抗体适于筛查A S F V感染后存活猪或无症状感染猪的检测靶标。用原核或真核表达系统表达的A S F V重组抗原已成为用活病毒或灭活病毒的抗体检测的重要替代方法。原核表达系统具有成本低、用时短、适于大DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.024规模生产的优势。p C o l dT F载体上的T F标签作为分子伴侣,有助于肽链的正确折叠,并提高蛋白的可溶性。本研究用p C o l dT F载体表达具有可溶性的A S F Vp 5 4重组截短蛋白,探究该蛋白作为包被抗原应用于A S F V抗体检测的可能性,为开发A S-F V抗体检测方法奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株、载体和主要试剂 p C o l dT F载体、灭活的A S F V阳性血清,由青岛农业大学预防兽医学重点实验室保存;大肠埃希氏菌感受态细胞B L 2 1和DH 5、D NA标准D L10 0 0、限制性核酸内切酶E c oR和P s t、2P r e m i xE xT a qD NA聚合酶、M i n i B E S TV i r a lR N A/D N AE x t r a c t i o nK i tV e r.5.0试剂盒、人鼻病毒(H u m a nr h i n o v i r u s,HR V)3 CP r o-t e a s e试剂盒、P V D F膜,宝生物工程(大连)有限公司产品;I P T G、磷酸盐缓冲液(P B S)、D NA回收试剂盒、蛋白分子质量标准(1 1k u1 8 0k u)、S D S-P AG E凝胶制备试剂盒、4蛋白上样缓冲液,北京索莱宝科技有限公司产品;HR P标记的山羊抗猪I g G(H+L)、HR P标记的山羊抗小鼠I g G(H+L),艾博抗(上海)贸易有限公司产品;质粒小提试剂盒,天根生化科技有限公司产品;H i s标签蛋白纯化试剂盒、B C A蛋白定量试剂盒,北京康为世纪生物科技有 限 公 司 产 品;A S F V p 5 4单 抗(小 鼠),美 国G e n e T e x公司产品;蛋白分子质量标准(1 0k u1 8 0k u),山东思科捷生物技术有限公司产品;考马斯亮蓝染色液、蛋白分子质量标准(1 5k u1 3 0k u)、蛋白分子质量标准(1 0k u2 5 0k u),生工生物工程(上海)股份有限公司产品。1.1.2 仪器和设备 电子天平,上海精天电子仪器有限公司产品;琼脂糖水平电泳槽,北京六一生物科技有限公司产品;P C R扩增仪、电泳仪、小型垂直电泳槽、小型转印槽,美国伯乐公司产品;光凝胶成像系统,上海勤翔科学仪器有限公司产品;超速低温离心机、电热恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司产品;超声波细胞破碎仪,上海狄昊实业发展有限公司产品;脱色摇床,江苏其林贝尔仪器制造有限公司产品;紫外分光光度计,上海美谱达仪器有限公司产品;超低温冰箱,青岛海尔股份有限公司产品。1.2 方法1.2.1 重组质粒p C o l dT F-p 5 4的构建 根据G e n-B a n k收录的A S F V p 5 4基因片段(S e q u e n c eI D:K J 3 8 0 9 1 0.1),找到5 1-1 8 3位氨基酸相对应的基因序列,交由中美泰和生物技术有限公司合成。以合成的基因为模板并结合p C o l dT F载体上的酶切位点E c oR和P s t设计引物以扩增带有酶切位点的截短p 5 4基因片段,并通过琼脂糖凝胶电泳验证条带大小。上 游 和 下 游 引 物 序 列 分 别 为:p 5 4-F:5 -T AG A A T T CC T AT T C T C T T C AAGAAAG-3(下划线处为E c oR酶 切位点);p 5 4-R:5 -T AC T G-C A GT T A C AAG GAG T T T T C T AG G-3(下 划 线 处为P s t酶切位点)。引物交由青岛派森诺基因科技有限公司合成。P C R扩增体系如下:1 2.5L2P r e m i xE xT a qD NA聚合酶,0.5Lp 5 4-F,0.5Lp 5 4-R,1L模板,1 0.5Ld d H2O。P C R扩增程序为:9 51 0m i n;9 53 0s,5 83 0s,7 23 0s,共3 5个循环;7 2终延伸1 0m i n。胶回收P C R产物,经E c oR和P s t双酶切后连入p C o l dT F载体,转化至大肠埃希氏菌感受态细胞DH 5 中。进行菌液P C R验证,取阳性克隆菌的菌液送青岛派森诺基因科技有限公司测序。测序结果进行b l a s t比对。1.2.2 p 5 4重组截短蛋白的可溶性表达 将测序结果正确的阳性克隆菌的菌液扩大培养后用质粒小提试剂盒提取重组质粒,并转化到大肠埃希氏菌感受态细胞B L 2 1中。再次经菌液P C R验证后挑取阳性克隆菌落扩大培养。次日以31 0 0转接入5 0m L含Am p的L B培 养 液 中,于3 7摇 床 中 培 养 至O D 6 0 0n m值为0.6左右时分到各个培养管中,保持每管 菌 液 量 相 同。根 据 菌 液 体 积 加 入1 m o l/LI P T G使I P T G终浓度为1 mm o l/L,1 6诱导2 4h,同时将转化至感受态细胞B L 2 1中的p C o l dT F空载体菌作为相同诱导条件下的对照,并设置不加入I P T G的未诱导菌液作为阴性对照。2 4h后留取3 0L诱导后的重组菌液用于S D S-P AG E上样,将剩下的菌液置于冰浴中超声破碎至菌液由浑浊变为澄清。离心后分离出上清液,再用同等体积预冷的P B S重悬沉淀。在各个未诱导及诱导后的样品中各加入4蛋白上样缓冲液后煮沸,根据S D S-P AG E凝胶电泳确定蛋白是否可溶性表达。1.2.3 I P T G诱导浓度与诱导时间的优化 参考用p C o l dT F载体表达蛋白的已发表文献,可知诱导表达时多选用1 6。因此,将1 6作为诱导温度,在这个基础上优化了I P T G添加浓度及诱导时间。取适量重组菌过夜活化后,隔天进一步扩大培养,当O D 6 0 0n m值为0.6左右时将重组菌液分到各个培养管中,使每管含有相同体积的菌液。之后依次分别加入不同体积的1m o l/LI P T G使得I P T G终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2mm o l/L,1 6诱2动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)导2 4h。最后根据S D S-P AG E凝胶电泳及考马斯亮蓝染色的结果判断p 5 4重组截短蛋白的表达情况,从而可筛选出最优的I P T G添加浓度。按照筛选出的最优I P T G诱导浓度添加I P T G后,将重组菌液置于1 6下分别诱导3、6、9、1 2、2 1、2 4h。最后根据S D S-P AG E凝胶电泳结果筛选出最优的