发酵桦褐孔菌诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡的作用研究_朴淳健.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：吉林省中医药科技项目（）；吉林省大学生创新创业训练计划项目（）作者简介：朴淳健（），男（朝鲜族），吉林延吉人，延边大学医学院学生通讯作者简介：陈正爱（），女（朝鲜族），吉林延吉人，延边大学医学院副教授，博士学位，主要从事肿瘤药理学研究工作发酵桦褐孔菌诱导人肝癌细胞 凋亡的作用研究朴淳健，魏宇轩，赵国钧，王虹力，陈正爱（延边大学医学院，吉林 延吉）摘要：目的 探讨发酵桦褐孔菌（）诱导人肝癌细胞 凋亡的作用及机制。方法 法测定细胞增殖，染色法观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期，蛋白免疫印迹法检测细胞内的凋亡相关蛋白的表达。结果 显著抑制 细胞的增殖，且具有时间和剂量相关性；作用于 细胞后出现明显凋亡形态、凋亡率显著增加且呈浓度依赖性，细胞周期明显阻滞在 期；各剂量组细胞内 ，和 蛋白表达均显著升高，而 和 蛋白表达显著减少，且其作用呈现浓度依赖性。结论 对 细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，而线粒体通路可能参与调节 诱导 细胞凋亡的作用。关键词：发酵桦褐孔菌；肝癌 细胞；细胞凋亡 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：（），：；桦褐孔菌 （）属担子菌门、伞菌纲、多孔菌目、多孔菌科木腐真菌。野生桦褐孔菌主要生长在俄罗斯、芬兰、波兰、北美、日本北海道及我国黑龙江和吉林等高纬度地区（北纬 ）桦树等树木的树皮下或枯干上，在自然界通常以不孕子实体形式存在。桦褐孔菌的主要药理作用包括抗癌、抗氧化、免疫调节、降低疲劳、抗炎、抗细菌、抗真菌、降低血糖等，且几乎无不良反应的报道，但野生桦褐孔菌资源的有限和生长条件的苛刻却严重限制了其广泛应用。近年来，人工发酵技术的进步为桦褐孔菌的工业化应用提供了条件。目前，有关野生桦褐孔菌的化学成分、药理作用及其机制均有报道，但对发酵桦褐孔菌（，）抗肝癌作用及其机制的报道少见。因此，本实验在课题组前期研究的基础上，利用人肝癌细胞 观察 对其凋亡的影响并探讨其作用机制，为桦褐孔菌的开发利用提供实验依据。材料与仪器 药药品品与与试试剂剂 由延边高丽酿造有限公司提供；细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒、蛋白浓度试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；，的抗体和二抗 购自美国 公司；和 的抗体购自南京凯基生物有限公司；抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。细细胞胞株株 人肝癌 细胞株购自中科院上海细胞库，在含 胎牛血清的 培养基中，、的条件下常规培养，并以 胰蛋白酶消化细胞并传代，取对数生长期细胞用于实验。仪仪器器 流式细胞仪为德国 公司产品；型自动酶标仪为芬兰 公司产品；凝胶成像分析仪为美国 公司产品；荧光图像分析仪为日本 公司产品；转膜槽为美国 公司产品；倒置显微镜为日本日立公司产品。方法 实实验验分分组组及及处处理理 每次实验取对数生长期的 细胞，经 胰酶消化后制成细胞悬液，置于 培养皿中，待细胞贴壁后，吸尽原培养液，换用加有 的培养液，设置药物浓度为，剂量组，继续培养，后，分别进行以下实验。法法检检测测细细胞胞增增殖殖 取对数生长期 细胞制成浓时珍国医国药 年第 卷第 期 度为 的细胞悬液。给药组药物浓度分别为，。另设空白对照组（无细胞）、对照组（不加药），每组设 个平行样本。分别培养，后，弃去原培养液加入（），继续培养 ，加入二甲基亚砜（），振荡。在全自动酶标仪上测定 处吸光值（值）按公式计算药物抑制率。每次实验重复测定 次。细细胞胞形形态态观观察察 取对数生长期 的细胞，调节浓度至 后等量加入放有载玻片的 孔板，加入适量培养液培养，待细胞贴壁后，实验分为对照组、给药组浓度为，的 组。细胞爬片进行 常规染色，并在光学显微镜（）下观察。双双染染法法测测肝肝癌癌细细胞胞凋凋亡亡率率 取对数生长期肝癌 细胞制成 细胞悬液，加入 溶液并调节终浓度分别为，同时设置不加药物对照组，后加入 室温避光轻轻地混匀 ，检测前加入 碘化丙啶溶液（），室温避光孵育，用 尼龙网过滤细胞并立即用流式细胞仪检测（在 内检测完），分析细胞凋亡率。流流式式细细胞胞仪仪检检测测 细细胞胞细细胞胞周周期期 取对数生长期细胞制成浓度为 个 细胞悬液，加入 溶液并调节终浓度分别为，同时设置不加药物对照组，后收集细胞离心，弃去上清液，用 预冷 洗 次后，和 预冷 乙醇混匀，固定过夜；加入 （现配现用）混匀，避光染色 ，用 尼龙网过滤细胞，上机检测（波长为 ），分析细胞各周期时相的百分率。法法检检测测细细胞胞内内凋凋亡亡相相关关蛋蛋白白表表达达 预实验结果表明，和 的 对 细胞内凋亡相关蛋白表达的影响相似，因此，为了分析 影响细胞内凋亡相关蛋白表达的剂量关系，此步骤实验中 的浓度选择，。取对数生长期的细胞制成细胞悬液，调节细胞浓度为 ，加入等量含 浓度分别为，培养液，对照组加入等体积的无血清培养液，培养 。加 裂解液提取蛋白；蛋白样品和标准品用 蛋白浓度试剂盒计算蛋白浓度；将所得蛋白样品加入适量，、变性，通过 凝胶电泳分离，切取目的条带转移至 膜，脱脂牛奶封闭 。利用 ，和 的一抗抗体 孵育过夜，缓冲液 洗遍后二抗常温孵育 ，洗膜后 显色曝光，置于 凝胶成像分析仪中采集图像并用 软件分析灰度。统统计计分分析析 采用 软件进行统计分析，实验数据以?表示，进行 检验和单因素方差分析，以 为有差异，具有统计学意义。结果 对对 细细胞胞增增殖殖的的影影响响 如图 所示，与对照组相比，各剂量组 对 细胞均有显著的抑制作用，且具有时间和剂量相关性，即当给药处理时间逐渐延长或者药物浓度逐渐增加时，药物对肝癌细胞的抑制作用明显增加。当 浓度为 、给药时间为 时，对 细胞的抑制率为，与药物的半数抑制浓度（）接近。因此，本实验利用，的 处理 细胞 后观察其细胞凋亡和细胞周期。对对 细细胞胞形形态态的的影影响响 如图 所示，对照组细胞生长状态良好，形态完整密度大、形态舒展且抱团生长，呈梭形或多角形，细胞质、核染色均匀；与之相比，各剂量组 细胞呈现明显细胞抑制和凋亡形态，即原有形态基本消失、呈无结构形态，细胞核固缩、染色加深呈圆形，视野中细胞数明显减少，并且随着给药浓度的增加和作用时间的延长，细胞形态变化越明显。对对 细细胞胞凋凋亡亡率率的的影影响响 用不同浓度的 作用于 细胞 后，用 双染流式细胞术检测其凋亡率，结果显示（见图），的 均显著诱导 细胞的凋亡，其细胞凋亡率依次为 ，和 （与对照组的 相比，），且其作用呈明显的浓度依赖性。与对照组相比，图 对 细胞增殖的影响：对照组；：；：；：图 作用 对肝癌 细胞形态的影响 时珍国医国药 年第 卷第 期：对照组：图 对 细胞凋亡率的影响 对对 细细胞胞周周期期的的影影响响 利用流式细胞仪观察不同浓度的 细胞周期的影响，结果如图 和表 显示，与对照组相比，各剂量组中 期细胞占总细胞数目的比例显著升高（），而 期和 期细胞所占比例均显著下降（），提示 可阻滞 细胞于 期，诱导其凋亡。对对 细细胞胞 和和 蛋蛋白白表表达达的的影影响响 与对照组比较，各剂量组 细胞的 和 蛋白的表达均显著升高（，），而 和 蛋白的表达均显著减少（，），且其作用呈现浓度依赖性（见图）。：对照组：图 对 细胞周期的影响表 对 细胞周期的影响组别 对照组 （）（）（）与对照组相比，时珍国医国药 年第 卷第 期 与 组比较，图 对 细胞 （）和（）蛋白表达的影响 对对 细细胞胞 蛋蛋白白表表达达的的影影响响 与对照组比较，组 细胞的 蛋白表达无显著变化（），但在 ，组 细胞，蛋白表达均显著升高（），且其作用呈现浓度依赖性（见图）。与 组比较，图 对 细胞 蛋白表达的影响 对对 细细胞胞 和和 蛋蛋白白表表达达的的影影响响 与对照组比较，各剂量组 细胞的 蛋白表达均显著升高（，），且其作用呈现浓度依赖性（见图）。与对照组比较，组 细胞的 表达无显著变化，而其他剂量组 细胞的 蛋白表达均显著升高（），且其作用呈现浓度依赖性（见图）。与 组比较，图 对 细胞 （）和（）蛋白表达的影响 讨论近年来研究发现桦褐孔菌提取物对 、等多种恶性肿瘤细胞有抑制作用。本实验通过 法测定 对 细胞增殖的抑制率，结果显示 在一定浓度范围能显著抑制肝癌 细胞的增殖，抑制率呈时间和浓度依赖性。不仅如此，流式细胞术的实验结果显示，处理 细胞 小时后出现典型的细胞凋亡峰，且其凋亡程度与剂量呈正相关，同时，作用后 细胞 期细胞比率显著升高，而 期和 期细胞比率均显著下降，提示 可能通过 期阻滞，诱导人肝癌 细胞的凋亡。目前研究发现凋亡途径主要包括 条，即经死亡受体介导的外源性途径、内源性途径（又称线粒体途径）、颗粒酶 途径和内 时珍国医国药 年第 卷第 期质网途径。在线粒体调节通路中 蛋白家族是重要的调节因子，可分为凋亡抑制蛋白和促凋亡蛋白两大类。和 分别是 蛋白家族中典型的凋亡抑制蛋白和促细胞凋亡蛋白，两者的比值（）成为“凋亡开关”，决定细胞是否进入凋亡状态。在线粒体调节途径中，线粒体细胞色素（）释放到胞质中，与 形成凋亡小体，使 前体（）被催化形成有活性的 ，继而被激活的 激活效应酶 ，最终诱导凋亡。此外，作为重要的细胞凋亡调控蛋白，可通过上调 的表达及下调 的表达共同完成促进细胞凋亡的作用，同时还可促进周期蛋白依赖性激酶抑制因子的表达引起细胞 期阻滞。本实验通过蛋白免疫印迹法检测 细胞中上述的凋亡相关蛋白的表达情况，结果显示，作用于 细胞后，线粒体介导的凋亡通路所涉及的一系列信号分子出现浓度依赖性的明显变化，即促凋亡蛋白 和 的表达增加、凋亡抑制蛋白 的达减少、线粒体内凋亡因子 的表达增加、线粒体通路下游的 和 被剪切活化。这些结果表明，线粒体通路可能参与调节 诱导 细胞凋亡的作用。综上所述，发酵的桦褐孔菌（）对人肝癌 细胞具有显著的增殖抑制和诱导凋亡的作用，且线粒体介导的凋亡通路可能参与其中，但 对其他凋亡途径的作用及机制有待于进一步研究。参考文献：李 青 桦褐孔菌多糖的提取、纯化及其抗肿瘤活性研究 青岛科技大学硕士学位论文，戚月婷，玄光善 桦褐孔菌总三萜提取工艺的研究 应用化工，（）：，（）：，：马伟平，侯睿，王昊月，等 发酵桦褐孔菌诱导肝癌 细胞的凋亡作用 医学研究生报，（）：王李俊，杨 琴，王飞，等 桦褐孔菌醇诱导人乳腺癌 细胞凋亡的分子机制研究 中草药，（）：，（）：，（），（）：，：张振宇，田雪梅，卜祥辉，等 桦褐孔菌提取物体外抗肿瘤作用研究 中国菌物学会学术年会论文集，年 李 敏，林 俊 细胞凋亡途径及其机制 国际妇产科学杂志，（）：许 慧 莲房原花青素诱导 积蓄介导 细胞自噬和凋亡的研究 江苏大学硕士学位论文，：，：收稿日期：；修订日期：基金项目：广东省自然科学基金（）作者简介：曹刘丹（），女（汉族），河南商丘人，广东药科大学中药学院在读硕士研究生，主要从事中药的应用开发研究工作通讯作者简介：李 钟（），女（汉族），湖南衡阳人，广东药科大学副教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事中药资源开发与品质评价研究工作通讯作者简介：田素英（），女（汉族），河南商丘人，广东药科大学副教授，硕士学位，主要从事中药的应用开发与教学工作独活化学成分及抗骨质疏松活性评价曹刘丹，胡 晨，顾 琼，何 琳，滕希峰，田素英，李 钟，（广东药科大学中药学院，广东 广州；中山大学药学院，广东 广州；广东药科大学广东省化妆品工程技术研究中心，广东 中山；国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室，广东 广州；）摘要：目的 研究独活（）根的化学成分及其抗骨质疏松活性。方法 采用硅胶、等层析柱及半制备高效液相色谱对独活根部分 乙醇提取物进行分离纯化，通过核磁共振波谱、质谱以及与文献数据比较，进行结构鉴定。结果 从独活中分离得到 个化合物，分别鉴定为蛇床子素（），（），欧芹酚（），（），补骨脂素（），香柑内酯（），氧化前胡素水合物（），（）（），二氢欧山芹醇乙酸酯（），二氢欧山芹素（），二氢欧山芹醇（），（），当归醇（），（），没药当归烯酮（），（），（，），（），（，），（），十八烷二烯酸甲脂（）和（）。结论 化合物，和 为首次从该植物中