福建省莆田市鸭疫里默氏杆菌...检测与QRDR基因突变分析_林彬彬.pdf

林彬彬，林志敏，谢碧林，等.福建省莆田市鸭疫里默氏杆菌的喹诺酮类耐药基因检测与 QRDR 基因突变分析J.福建农业学报，2022，37（11）：14001406.LINBB,LINZM,XIEBL,etal.DetectionofQuinoloneResistanceGenesandQRDRMutationinRiemerella anatipestifer FoundinPutian,FujianJ.Fujian Journal of Agricultural Sciences，2022，37（11）：14001406.福建省莆田市鸭疫里默氏杆菌的喹诺酮类耐药基因检测与 QRDR 基因突变分析林彬彬1，林志敏1*，谢碧林1，翁汉东1，王秀祯1，程龙飞2，傅光华2，刘荣昌2（1.福建省莆田市农业科学研究所，福建莆田351144；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州350013）摘要：【目的】了解目前福建省莆田市鸭疫里默氏杆菌菌株对喹诺酮类相关耐药基因的携带情况，探讨其耐药机制。【方法】采用 K-B 法对 20192021 年分离自福建省莆田市的 55 株鸭疫里默氏杆菌菌株进行 6 种喹诺酮类药物的药敏试验，采用 PCR 方法对喹诺酮耐药决定区基因（QRDR）和质粒介导的喹诺酮耐药基因（PMQR）等 6 种耐药基因进行检测并分析。【结果】在 55 株鸭疫里默氏杆菌菌株中，50%以上菌株对吡哌酸、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星高度耐药，且为多重耐药；90%以上菌株对氧氟沙星高度敏感。耐药基因 PCR 检测结果显示，未检测到qnrA、qnrB、qnrS、oqxA 等 4 种质粒介导的喹诺酮耐药基因。QRDR 突变分析发现，gyrA 基因推测氨基酸序列中有6 个 位 点 发 生 突 变，突 变 类 型 有 S83R 和 S83I、S84P、D87A 和 D87G、A183V、N202E、Y211H；其 中 以 S83I、N202E、Y211H 的突变最多见，突变率分别为 98.18%（54/55）、92.73%（51/55）、90.91%（50/55）；39 株耐恩诺沙星菌株中 gyrA 基因出现 S83I（38/39）和 S83R（1/39）突变，S83I 突变也在 3 株恩诺沙星敏感菌株中发现。parC 基因只在 1 株恩诺沙星中介菌株中出现 F155S 突变，这在鸭疫里默氏杆菌中未见报道。【结论】莆田市鸭疫里默氏杆菌的喹诺酮类药物耐药严重，未发现质粒介导的喹诺酮耐药基因，gyrA 基因的 S83I 突变可能是介导鸭疫里默氏杆菌对喹诺酮类药物耐药的主要机制之一。关键词：鸭疫里默氏杆菌；喹诺酮类；耐药基因；gyrA 基因；parC 基因中图分类号：S852.61文献标志码：A文章编号：1008-0384（2022）11140007Detection of Quinolone Resistance Genes and QRDR Mutation in Riemerellaanatipestifer Found in Putian,FujianLINBinbin1,LINZhimin1*,XIEBilin1,WENGHandong1,WANGXiuzhen1,CHENGLongfei2,FUGuanghua2,LIURongchang2（1.Putian Institute of Agricultural Sciences,Putian,Fujian351144,China;2.Institute of Animal Husbandry and VeterinaryMedicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou,Fujian350013,China）Abstract:【Objective】Epidemiologyandmechanismofquinolone-relateddrugresistancegenesofRiemerella anatipestiferfoundinducksinPutian,Fujianwereinvestigated.【Method】TheK-Bmethodwasappliedtoexamine55strainsofR.anatipestifertodeterminetheirresistanceto6typesofquinolones.PCRwasemployedtodetectandanalyzethequinoloneresistancedeterminingregion(QRDR)andplasmidmediatedquinoloneresistance(PMQR)genes.【Result】Morethanhalfof the 55 strains examined were multi-resistant and highly resistant to pipemidic acid,norfloxacin,enrofloxacin,andciprofloxacin;andmorethan90%ofthemhighlysensitivetoofloxacin.PCRdidnotfindthe4PMQRs,i.e.,qnrA,qnrB,qnrS,andoqxA,inthespecimens.Ontheotherhand,6QRDRmutationsinthededucedaminoacidsequencesofgyrA,includingS83RandS83I,S84P,D87AandD87G,A183V,N202E,andY211Hweredetected.Amongthem,S83I,N202E,andY211Hhadthehighestmutationratesof98.18%(54/55),92.73%(51/55),and90.91%(50/55),respectively.Ofwhich,theS83I收稿日期：20220629初稿；20221017修改稿作者简介：林彬彬（1986），女，硕士，助理研究员，研究方向：家禽疫病的诊断与防治研究（E-mail：）*通信作者：林志敏（1967），男，副研究员，研究方向：家禽疫病的诊断与防治研究（E-mail：）基金项目：福建省科技计划农业引导性（重点）项目（2019N0038）福建农业学报2022，37（11）：14001406http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.011.005(38/39)andS83R(1/39)mutationswerefoundingyrAof39enrofloxacin-resistantstrains,andtheS83Imutationsalsointhatof3enrofloxacin-sensitivestrains.Therewasonlyoneenrofloxacin-intermediatedstrainthathadtheF155SmutationinparC,whichwasnotpreviouslyreportedtoexistinR.anatipestifer.【Conclusion】Thequinolone-resistanceofR.anatipestiferfoundinducksinPutianwassevere.NoPMQRwasdetectedinthesamples,buttheS83ImutationingyrAofQRDRcouldbethemajorculpritthatinvolvedinthedrugresistanceofR.anatipestifer.Key words:Riemerella anatipestifer；quinolones；drugresistancegene；gyrA gene；parC gene0引言【研 究 意 义】鸭 疫 里 默 氏 杆 菌（Riemerellaanatipestifer，RA）是一种革兰氏阴性短杆菌，无芽孢、菌毛、鞭毛，有荚膜。18 周龄鸭易感，患病鸭出现精神颓废、共济失调、眼鼻分泌物增多、腹泻等临床症状，剖检可见纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎，是养鸭业重要的细菌传染病病原之一，严重危害水禽养殖业的健康发展。同时，还可导致鹅1,2、火鸡3等发病，使其生长缓慢。现有研究发现，鸭疫里默氏杆菌对喹诺酮类药物的耐药程度日趋严重46，而莆田市作为福建省小日龄水禽交易的集散地，了解莆田市鸭疫里默氏杆菌对喹诺酮类药物的耐药现况和耐药机制，对指导临床合理使用该类药物、控制其耐药菌株的出现具有重要意义。【前人研究进展】喹诺酮类药物，也称为吡酮酸类或吡啶酮酸类，是一类广谱、高效的化学合成抗菌药物，目前仍被广泛用于人和动物的细菌感染治疗。其作用靶点为细菌 DNA 螺旋酶和拓扑异构酶，形成药-酶-DNA 三元复合体，阻碍细菌蛋白质的合成，从而达到抑菌的目的7。细菌对喹诺酮类药物产生耐药的机制主要有 5 种：（1）细菌染色体上的喹诺酮耐药决定区（Quinoloneresistancedeterminationalregion，QRDR）靶基因发生突变，包括编码 DNA 旋转酶的 gyrA、gyrB 基因和编码拓扑异构酶 IV 的 parC、parE 基因；（2）质粒介导的喹诺酮耐药（Plasmidmediatedquinoloneresistance，PMQR），包 括 qnr 基 因 家 族（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD 和qnrS）、氨基糖苷乙酰转移酶基因 aac-(6)-Ib-cr 以及编码外排泵蛋白基因 qepA 和 oqxAB；（3）主动外排泵机制引起8；（4）细菌外膜通透性改变9；（5）细菌生物被膜的产生10。耐药菌株携带的耐药基因可以通过质粒、整合子、转座子、噬菌体等可移动遗传元件进行转移，使得细菌耐药性快速传播，多重耐药菌株的出现也越来越多，加大了临床治疗难度。而随着研究的不断深入，发现 gyrA 基因突变和qnr 基因家族在临床菌株中流行，其对细菌耐药性的影响已引起广泛关注11，12。【本研究切入点】鸭疫里默氏杆菌是莆田市小日龄鸭临床常见病原菌之一，莆田市鸭疫里默氏杆菌的喹诺酮类相关耐药基因携带情况和 gyrA、parC 基因 QRDR 突变情况及其与喹诺酮类药物耐药相关性的研究亟需进行。【拟解决的关键问题】本研究通过对 20192021 年分离自福建省莆田市的 55 株鸭疫里默氏杆菌菌株进行4 种质粒介导的喹诺酮耐药基因（PMQR）检测，并对其 gyrA、parC 基因耐药决定区进行序列比对分析，探究质粒介导的喹诺酮耐药基因和 gyrA、parC基因突变情况与鸭疫里默氏杆菌喹诺酮类药物耐药的相关性，为鸭疫里默氏杆菌喹诺酮类药物的耐药机制提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1试验菌株鸭疫里默氏杆菌 55 株，由莆田市农业科学研究所于 20192021 年从福建莆田市荔城区、秀屿区等养殖场（户）采集并分离鉴定保存。1.1.2主要试剂胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、麦康凯琼脂培养基购自北京索莱宝科技有限公司；新生胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；恩诺沙星（ENR，10g片1）、环丙沙星（CIP，5g片1）、氧氟沙星（OFX，5g片1）、诺氟沙星（NOR，10g片1）、萘啶酸（NA，30g片1）、吡哌酸（PPA，30g片1）等 6 种药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；无内毒素质粒大提试剂盒、2TaqPCRMasterMix、GeneRed 核酸染料、DL2000DNAMarker购自天根生化科技有限公司。1.1.3引物设计与合成根据已发表的鸭疫里默氏杆菌 RA9913 的 gyrA 基因序列（登录号 JN969052.1）、parC 基因序列（登录号 JN969