粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的...其催化氨苄西林半合成的探析_李京喜.pdf

2022 年 第 12 期 化学工程与装备 2022 年 12 月 Chemical Engineering&Equipment 31 粪产碱杆菌青霉素粪产碱杆菌青霉素 G G 酰化酶的分子改造酰化酶的分子改造 及其催化氨苄西林半合成的探析及其催化氨苄西林半合成的探析 李京喜，杨 政，黄 磊，宋祥熙（山东二叶制药有限公司，山东 菏泽 274100）摘摘 要要：本文针对青霉素 G 酰化酶的分子改造要点进行分析，并通过化学实验的方式阐述青霉素 G 酰化酶对氨苄西林的催化作用。根据实验结果可知，固定化 Af PGA 的最佳 PH 值为 9.0，最适宜的温度为 47，在存放 16h 后酶活保留可超过 90%；固化酶温度低于 40时，保温 4h 活力保留超过 96%。当固化时间在3648h 之间时，酶活力为最高状态；当离子强度越高时，越有助于酶-载体固定化反应发生；将投酶量控制在 500550IU/g wet carrier 较为合理，此时回收率约为 48%。关键词：关键词：青霉素 G 酰化酶；粪产碱杆菌；氨苄西林 引引 言言 在抗细菌感染类药物中，-内酰胺类抗生素的应用范围最广，年产量较多，销量可观。自从 20 世纪中期开始，化学领域专家开始注重化学制备半合成抗生素的工艺研究，最为典型的方法是丹磺酰氯法。该工艺采用活性较强的特戊酰氯试剂，延长合成路线，一些步骤对反应温度要求较高，且能耗较大，很容易破坏生态环境。与化学法相比，酶法合成抗生素更加绿色友好，主要采用青霉素酰化酶，在特定反应条件下，利用该物质催化酰基供体，使内部衍生物发生化学反应，由此制备出半合成抗生素。1 1 粪产碱杆菌青霉素粪产碱杆菌青霉素 G G 酰化酶的分子改造要点酰化酶的分子改造要点 该物质是在半合成抗生素基础上研发的青霉素 G 碱化酶的一种，应用范围较为广泛1。在对突变状态的 Af PGA纯化处理后，将其设定到环氧基载体中，浓度与酰基供体的比例设置为 1.05:1，制备氨苄西林。上述反应条件为：选取 0.04g/ml 突变 Af PGA、15%（v/v）甘油，pH 酸碱度设定为 5.8，在温度为 20%的环境下进行反应。根据反应结果可知，6-APA 转化率在反应前为 68%，反应后达到 95.6%，反应共计持续 600min，可见，以绿色溶剂甘油可促进氨苄西林酶法合成。通过充分发挥突变子、野生酶的催化作用，使二者能够两步直接合成氨苄西林工艺，由此优化母核分离纯化流程。在实施过程中，先将水解反应时间设定为 45min，产率为 97%，然后对反应条件优化处理，采用 0.19g/ml 的突变 Af PGA、PH 设定为 6.3，D-PGME 与 6-APA 的浓度比值设定为 1.5:1，在 28环境下持续反应 235min，此时转化率为 90%；如若将时间延长到 280min，则转化率降低到 87%。同时，氨苄西林制备中 D-PGME 所用剂量大大减少，节能环保，经济性强，且优化后的青霉素酰化酶的应用路径进一步拓展，为抗生素合成工艺创新提供了新思路。2 2 青霉素青霉素 G G 酰化酶对氨苄西林的催化实验酰化酶对氨苄西林的催化实验 2.1 材料与仪器 胺基载体 ZH-HA、牛血清白蛋白、青霉素 G 钾盐、95%乙醇、氢氧化钠、磷酸二氢钾、丙三醇、无水乙酸钠。所用仪器包括型号为 THZ-031 的温控摇床、DK600 型电热恒温水相、电子天平、冷冻离心机、可见分光光度计。2.2 实验方法（1）青霉素酰化酶制备。首先对载体进行预处理，利用去离子浸泡 Eupergit CM，缓慢搅拌均匀后放置 30min，使杂质沉降后取上层悬浮颗粒，用 3 号砂芯过滤；然后取适量的湿载体放入磷酸钾缓冲液内，与 PA 酶液混合后，确保最终载体的质量与体积比值为 1:6，将混合溶液摇晃均匀后，放入转速较低的摇床内，在特定温度下进行反应；最后，在过滤后获得固定化酶，利用大量磷酸钾溶液进行冲洗、搅拌和过滤，再利用 0.1M，pH 酸碱度为 8.0 的磷酸钾溶液进行冲洗，过滤三次后存储到带有 80%甘油的磷酸缓冲液内2。（2）酶活力测定。采用 Kutzbach 法对酶溶液进行测定。选取 50ul 稀释过的酶液，将带有 450ul 的 NIPAB，在 pH 酸碱度为 7.5，温度为 37的水浴内注入 0.5ml 的无水乙醇，经过中止反应后对 405nm 位置的吸光值进行测定，空白位置无须加入酶反应液。将酶活力定义为 37下 1min 水解所需的 NIPAB 剂量。在固定化酶测定中，选取固定化酶颗粒，将其放入体积为 5ml 的小烧杯内，在杯中放入小型搅拌桨，以每分钟 300r 的速度转动。待搅拌均匀后，将 2ml 的 NIPAB在 37下预热处理，再在水浴中持续反应 4min，与无水乙醇中止反应后，采用 1ml 的反应液对 405nm 位置的吸光值进行测定。固定化效率可用酶活力与总酶量相除后计算得出，公式如下：gfW=式中，W 代表的是固定化效率；f 代表的是酶活力；g代表的是总酶量。DOI:10.19566/35-1285/tq.2022.12.02132 李京喜：粪产碱杆菌青霉素 G 酰化酶的分子改造及其催化氨苄西林半合成的探析（3）蛋白含量测定。该法是利用蛋白与染料相结合的方式设计而成，将带有酸性物质的染料与蛋白质融合后，对生产溶液进行光吸收，吸光值与蛋白浓度间为正比。在制定标准曲线时，可将 1mg/ml 的 BSA 标准品放入离心管内，剂量分别为 15ul、22.5ul、30ul、37.6ul 与 45ul，采用缓冲液补充 300ul；再将 3ml 的染色液添加到管内，摇晃均匀，在室温状态下静置 3min；利用比色皿测定 OD959，以吸光值为依据测定蛋白含量。当趋势线 R2 数值超过 0.98 时，可利用该标准曲线，方程可表示为：1152.0085.0+=xy 9895.02=R 式中，y 代表的是光密度值；x 代表的是蛋白含量，单位为 ug；R2 代表的是曲线趋势。2.3 实验结果 2.3.1 固化时间对固化效果的影响 将反应体系中的缓冲液 pH 酸碱度设定为 8.0，在固化60h 后对酶活与上清液蛋白含量进行测定，并对固定化酶活与蛋白结合率间的关系进行表示，如下图 1 所示3。图图 1 1 固化时间与固化酶活、效率间的关系固化时间与固化酶活、效率间的关系 固化酶活随着固化时间的延长而提升，经过 4h 的反应后，与时间开始成反比，在 8h 后趋势又开始回升，在 36h后酶活量增长速度开始放缓，经过 48h 后随着时间的推移开始缓慢降低。蛋白与时间的关系变化与酶活较为相似，但在48h 后逐渐稳定。随着酶分子量逐渐增加，物理酶分子逐渐进入到液相内，使载体外表的酶分子量降低，蛋白结合率也逐渐下降。后续随着时间推移，逐渐彻底变成化学吸附，且载体外表酶分子量大幅度增加，使蛋白结合率也飞速提升，在 48h 后才逐渐稳定下来。可见，当固化时间低于 8h 时，固化酶的稳定性较弱，有许多酶以物理形式附着在载体外表，化学键合不够彻底。在 3648h 之间，蛋白结合率逐渐稳定下来，此时酶活力为最高状态，应将固化时间控制在3648h 之间，取得良好的效果。2.3.2 离子强度对固化效果的影响 选取重量为 1g、预处理过的载体，放入 4ml 离子强度不同的磷酸钾溶液，在温度为 23摇床上固化 36h，转速设定为 150rpm，洗涤液离子强度为固化时所用离子强度的50%，经过水洗和抽滤处理后，对酶活与上清酶活进行测定，对酶活力回收率进行计算。根据反应体系可看出离子强度不同，固化酶活、效率等也会受到不同影响，如图 1 所示。当离子强度为 0.51.0M 之间时，固化酶活逐渐提升，回收量则逐渐降低。因固化效率较低，仅为总酶活的 1030%之间，以酶活力收率为主要评价标准。当离子强度逐渐提升时，酶蛋白经过盐溶反应后，一些蛋白沉淀下来，使整体溶液变得浑浊，再加入反应体系后，溶解速度逐渐提升，沉积量随之增加，使酶活力损失加剧。从整体上看，当溶液内盐度较高时，载体与酶蛋白间的疏水力将明显提升，蛋白更易集结在载体表面，出现共价酶联合反应。可见，当离子强度越高时，越有助于酶-载体固定化反应发生，由此获得更多的固定化酶活4。图图 2 2 离子强度与酶活、酶回收间的联系离子强度与酶活、酶回收间的联系 2.3.3 投酶量对固化效果的影响 将不同剂量的酶溶液加入反应体系内，溶液剂量在2002000ul 之间，酶溶液活性为 346.65IU/ml，加入剂量为 50mM、pH 酸碱度为 7.5，在温度为 30的环境下固化 24h，冲洗过滤处理后测定固化酶活，酶活最高值为 100%，针对固化酶活表观偶联效率、回收率、相对表达酶活间的联系进行分析，如图 3 所示。图图 3 3 投酶量与回收率、相对表达酶投酶量与回收率、相对表达酶 活、表观偶联效率间的联系活、表观偶联效率间的联系 在酶活量成倍增长状态下，固化酶活表观欧联效率始终较高，回收率略微下降，意味着该体系内酶浓度较低，酶分子可灵活的与载体融合，且载体表面可供键合的环氧基团数量超过溶液内酶分子数量，使酶分子始终分散在载体表面，减少了酶活性损失，投酶量与酶活表达为正相关关系。当投酶量大于 400ul 时，酶活的增长率 （下转第（下转第 5151 页）页）魏延传：新型 VHP 灭菌工艺在“BIBO”系统中的应用 51 5 5 结论与展望结论与展望 新型 VHP 灭菌工艺是对传统加热闪蒸技术的升级，在较低温度状态下完成灭菌，确保灭菌全过程的安全性。该工艺对过氧化氢纯度要求较低，适用性强，灭菌过程中腔体内不会有试剂残留，便于设备的维护和管理。过氧化氢气体在循环风机作用下以较小的粒径，较大的风速扩散至灭菌空间，穿透性强，可以穿透 HEPA 过滤器，因此可为生物安全柜、局部 RABS 系统、隔离器等含有 HEPA 高效的设备、系统进行灭菌。本文首次报道了新型 VHP 灭菌工艺对高等级生物安全实验室“BIBO”系统的灭菌挑战，三次平行试验杀灭对数值均不小于 6，顺利通过了第三方验收，并获得 CMA 认证。生物安全实验室是一座坚不可摧的“堡垒”，高效过滤器则是“堡垒”与外界相通的“窗户”，当然也是病原微生物的集中地带，如何把好生物安全领域最后的“关口”，将拦截住的病菌进行有效杀灭，防止病菌蔓延传播，一直是生物安全行业的焦点。新型 VHP 灭菌工艺在生物安全、制药等领域所带来的技术革新，实现了对病原微生物的有效控制，为生物安全实验室的发展保驾护航。参考参考文献文献 1 张文福.汽化过氧化氢消毒技术及其生物安全领域的应用J.中国消毒学杂志,2017,34(10):959-962.2 毛小荣,刘艳,李建彬,等.VHP 厂房灭菌研究J.化学与医药工程,2018,39(3):26-29.3 Fichet G,Comoy E,Duval C,et al.Novel methods for disinfection of prioncontaminated medical devicesJ.Lancet,2004,364(9433):521-526.4 Kahnert A,Seiler P,Stein M.Decontamination with vaporized hydrogen peroxide is effective against Mycobacterium tuberculosisJ.Letters in applied microbiology,2005,40(6):448-452.5 Juergen KB,Gerald MB,Hermann RD.Biodecon-tamination of Animal Rooms and HeatSensitive Equipment with Vaporized Hydrogen PeroxideJ.Contemp top lab anim sci,2001,40(6):18-21.6 Jia H Q,Li Y J,Sun B,et al.Evaluat