扶正解毒化瘀方通过NLRP...菌慢性肺炎肺损伤的作用机制_崔兰凤.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 588 扶正解毒化瘀方通过NLRP3炎性体减轻多重耐药铜绿假单胞菌慢性肺炎肺损伤的作用机制崔兰凤1，李富增2，王玉婷3，赵世同4，王成祥5（1清华大学附属北京清华长庚医院，清华大学临床医学院，北京 102218；2北京市昌平区中医医院，北京 102200；3北京市和平里医院，北京 100013；4首都医科大学附属北京朝阳医院，北京 100020；5北京中医药大学第三附属医院，北京 100029）摘要：目的：观察扶正解毒化瘀方通过干预NLRP3炎性体减轻多重耐药铜绿假单胞菌（MDRPA）慢性肺炎肺损伤的作用机制。方法：将大鼠随机分为正常组、模型组、中药组、西药组、中+西组，通过经口气管插管法建立MDRPA慢性肺炎大鼠模型。中药组予扶正解毒化瘀方灌胃，每次1.4 g/mL，2次/d；西药组予哌拉西林他唑巴坦钠腹腔注射，每8小时1次；中+西组为两药联用。观察各时点肺组织病理变化。通过qPCR和Western blot观察NLRP3炎性体相关指标的基因和蛋白表达。结果：与模型组比较，中药组NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA水平在第14天和21天显著降低（P0.05），中药组、西药组和中+西组第14天时NLRP3、IL-1蛋白表达水平均显著下降（P0.05）。与模型组比较，中药组在第7、14天肺泡结构更完整，免疫细胞浸润更少，第21天时免疫细胞浸润和纤维细胞形成也更少。结论：扶正解毒化瘀方能明显减轻MDRPA慢性肺炎大鼠肺组织损伤，可能是通过调节NLRP3炎性体的表达而发挥作用。关键词：扶正解毒化瘀方；耐药；铜绿假单胞菌；慢性感染；NLRP3炎性体基金资助：国家自然科学基金面上项目（No.81573924）Mechanism of Fuzheng Jiedu Huayu Formula on lung injury of chronic pneumonia induced by multidrug resistant pseudomonas aeruginosa through NLRP3 inflammatory bodyCUI Lan-feng1,LI Fu-zeng2,WANG Yu-ting3,ZHAO Shi-tong4,WANG Cheng-xiang5(1Beijing Tsinghua Changgung Hospital,School of Clinical Medicine,Tsinghua University,Beijing 102218,China;2Beijing Changping District Hospital of Traditional Chinese Medicine,Beijing 102200,China;3Beijing Hepingli Hospital,Beijing 100013,China;4Beijing Chao-yang Hospital,Capital Medical University,Beijing 100020,China;5Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital,Beijing 100029,China)Abstract:Objective:To investigate the mechanism of Fuzheng Jiedu Huayu Formula in alleviating lung injury in rats with multidrug resistant pseudomonas aeruginosa(MDRPA)chronic pneumonia by intervening NLRP3 inflammatory body.The rats were divided into the normal group,model group,Chinese medicine group,western medicine group,Chinese+western group randomly.The rat model of MDRPA chronic pneumonia was established by oral tracheal intubation.The Chinese medicine group was given Fuzheng Jiedu Huayu Formula by gavage,1.4 g/mL per time,2 times/d.The western medicine group was given piperacillin tazobactam sodium by intraperitoneal injection,q8 h.The Chinese+western group was given the two medicine.The pathological changes of lung tissues were observed at various time points.The expression of genes and proteins related to NLRP3 inflammatory body was observed by qPCR and Western blot.Results:Compared with the model group,the levels of NLRP3 mRNA and Caspase-1 mRNA in the Chinese medicine group decreased significantly on the 14th and 21st days(P0.05),NLRP3 and IL-1 protein expression decreased significantly in the traditional Chinese medicine group,western medicine group and Chinese+western medicine group on the 14th day(P0.05).Compared with the model group,the Chinese medicine group had more complete alveolar structure,less immune cell infiltration on the 7th and 14th days,and less immune cell infiltration and 论著通信作者：王成祥，北京市朝阳区安定门外小关街51号北京中医药大学第三附属医院，邮编：100029，E-mail： 内文1.indd 5882023/2/10 16:56:51中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 589 铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是院内感染最常见的致病菌之一，且多引起慢性感染。生物膜的形成是慢性感染发生和持续的重要因素1。PA通过生物膜黏附在器械表面，增加院内感染发生率，研究显示呼吸机相关肺炎患者PA分离率为9.3%2。同时，PA存在较高的耐药率。中国细菌耐药监测网显示，2019年PA对碳青霉烯类药物的耐药率已达23.5%27.5%。鉴于PA耐药问题亟待解决，WHO在 2017年将其列为亟需开发新抗菌药的病原菌之一3。固有免疫是机体抵御感染的重要防线，其中NLRP3炎性体（NOD-like receptor 3 inflammatory body，NLRP3）是PA慢性感染引起免疫炎性损伤的重要途径。NLRP3炎性体可感知感染、组织损伤、应激等信号而被激活4。NLRP3和适配器凋亡相关蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）是NLRP3炎性体的基本结构，是激活胱天蛋白酶-1（cysteine-aspartase protease-1，Caspase-1）对ATP和某些毒素的反应所必需。激活后的Caspase-1能诱导产生白介素（interleukin，IL）-1和IL-15-6。同时，该途径与Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-B（nuclear factor-B，NF-B）通路相互作用，促进炎性反应级联式进展7。扶正解毒化瘀方对于老年耐药菌肺炎作用肯定8-9，并且能作用于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肺巨噬细胞，下调NLRP3的表达10。因此本研究建立多重耐药铜绿假单胞菌（multidrug resistant pseudomonas aeruginosa，MDRPA）慢性肺炎大鼠模型，深入探索该方通过调节NLRP3炎性体减轻MDRPA慢性肺炎肺损伤的作用机制。材料1.动物 SPF级雄性SD大鼠200只，68周龄，体质量170200 g。实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。购置动物在P2实验室适应性喂养1周。温度：18，相对湿度30，光照时间每日8 h。本研究通过北京中医药大学东直门医院伦理委员会审核（伦理批号：17-18）。2.药物、菌株与试剂 扶正解毒化瘀方由黄芩、连翘、漏芦、赤芍、瓜蒌、西洋参、败酱草、薏苡仁组成，由北京康仁堂药业有限公司制备成颗粒剂。MDRPA菌株为临床诊断为多重耐药铜绿假单胞菌肺炎的患者深部呼吸道分泌物标本经分离、培养、纯化、鉴定后获取，-80 冰箱保存。菌株编号：1607106，由北京中医药大学东直门医院检验科细菌室提供。哌拉西林他唑巴坦钠（Piperacillin tazobactam sodium，TZP）（批号：AKGD/11）由Wyeth Lederle S.R.L.生产。TRIzol Reagent（天根，批号：DP424），荧光定量PCR检测试剂盒（Genecopies，批号：AOPR-1200），BCA蛋白定量试剂盒（弗德生物，批号：FD2001）。3.仪器 微量核酸定量仪（Merinton，型号：SMA4000），荧光定量PCR仪（ABI，型号：7500），基因扩增仪（珠海黑马，型号：9600），磁力搅拌器（常州澳华仪器有限公司，型号：HJ-10-A）。方法1.分组、造模与取材 将大鼠随机分为正常组、模型组、中药组、西药组、中+西组，每组40只，每组每个时间点（第3、7、14、21天）10只。正常组大鼠予无菌0.9%氯化钠溶液0.1 mL，其余组予MDRPA海藻酸钠包被体混悬液0.1 mL（1.5107 CFU），经口气管插管建立MDRPA慢性肺炎模型11。中药组予扶正解毒化瘀方灌胃，每次1.4 g/mL，依据大鼠体质量给药，2次/日；西药组予1.8 mL/kg TZP腹腔注射，每8小时 1次；中+西组为两药联用。各组共给药21 d。造模后第3、7、14、21天留取肺组织。2.qPCR检测肺组织NLRP3炎性体的mRNA 水平 向破碎肺组织中加入1 mL的TRIzol Reagent，充分破碎细胞，与三氯甲烷充分混匀，4 下13 000g 离心8 min，与异丙醇混匀后，再次离心10 min，洗涤，获取总RNA。提取总RNA，逆转录后进行PCR反应。qPCR检测的引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，使用2-CT计算mRNA的相对表达量。引物序列见表1。3.Western blot检测肺组织NLRP3炎性体蛋白 水平 提取肺组织蛋白，测定蛋白浓度，上样，电泳，转