肺原位移植瘤小鼠模型的建立_杨星九.pdf

2022 年 12 月第 30 卷 第 8 期中国实验动物学报ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICADecember 2022Vol.30 No.8杨星九,张文龙,史旭东,等.肺原位移植瘤小鼠模型的建立 J.中国实验动物学报,2022,30(8):1064-1070.Yang XJ,Zhang WL,Shi XD,et al.Establishment of an orthotopic lung cancer model J.Acta Lab Anim Sci Sin,2022,30(8):1064-1070.Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2022.08.007基金项目中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-013)。Funded by the CAMS Innovation Fund for Medical Sciences(CIFMS)(2021-I2M-1-013).作者简介杨星九(1992),男,学士,研究方向:肿瘤模型创制。Email:yangxingjiu cnilas.org通信作者高苒(1980),女,博士,研究方向:肿瘤模型创制。Email:gaoran cnilas.org肺原位移植瘤小鼠模型的建立杨星九1,2,张文龙1,2,史旭东1,3,李梦媛1,3,张国新1,4,高苒1,2,3,4(1.中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心,北京 100021;2.国家人类疾病动物模型资源库,北京 100021;3.国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021;4.北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021)【摘要】目的 本研究拟建立一种小鼠肺癌原位移植瘤模型,用于模拟临床患者肺癌的发生及发展。方法 构建表达荧光素酶报告基因的小鼠肺癌细胞 LLC-luc,通过手术将 LLC-luc 细胞注射至小鼠左肺,构建原位移植瘤模型。使用 CT 和活体荧光成像系统对原位移植瘤模型进行示踪监测,并于肿瘤移植后第 14 天取材,IHC 检测组织免疫学及免疫微环境特征。结果 LLC-luc 细胞注射后,原位移植肿瘤成功定植于左肺,可通过 CT 和活体荧光成像示踪监测肿瘤的发展过程,IHC 结果显示肿瘤具备转移潜质,肿瘤内部存在免疫细胞浸润。结论本研究成功建立了一种易于评价,贴近于临床患者肺癌的发展的小鼠肺癌原位移植瘤模型。【关键词】肺癌;原位;移植瘤模型;影像学【中图分类号】Q95-33 【文献标识码】A 【文章编号】1005-4847(2022)08-1064-07Establishment of an orthotopic lung cancer modelYANG Xingjiu1,2,ZHANG Wenlong1,2,SHI Xudong1,3,LI Mengyuan1,3,ZHANG Guoxin1,4,GAO Ran1,2,3,4(1.Institute of Laboratory Animal Sciences,Chinese Academy of Medical Science(CAMS),Comparative Medicine Center,Peking Union Medical College(PUMC),Beijing 100021,China.2.National Human Disease Animal Model Resource Center,Beijing 100021.3.NHC Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine,Beijing 100021.4.Beijing Engineering Research Center for Experimental Animal Models of Human Critical Disease,Beijing 100021)Corresponding author:GAO Ran.E-mail:gaoran cnilas.org【Abstract】Objective A mouse orthotopic transplanted tumor model of lung cancer was established to simulate the occurrence and development of lung cancer in clinical patients.Methods The LLC cell line expressing a luciferase reporter gene was established(LLC-luc).LLC-luc cells were injected into the left lung of mice to establish an orthotopic tumor model.CT and in vivo fluorescence imaging were used for tracer monitoring of the orthotopic tumor model.Lung tumors were collected on day 14 after cell injection.The characteristics of tissue immunology and the immune microenvironment were assessed by IHC.ResultsAfter LLC-luc cell injection,a tumor had formed in the left lung.The tumor has a metastatic potential and immune cell infiltration was detected.ConclusionsWe successfully established a mouse model of orthotopic lung cancer,which is simple to evaluate and mimics the development of lung cancer in clinical patients.【Keywords】lung cancer;orthotopic;grafted tumor model;imagingConflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.肺癌是目前全球死亡率最高、且发生率第二的癌症1。目前肺癌治疗的主要方案是手术结合放疗和系统性化疗,然而在大多数临床病例中,肺癌仍然表现出明显的不良预后,肺癌患者的五年生存中国实验动物学报 2022 年 12 月第 30 卷第 8 期 Acta Lab Anim Sci Sin,December 2022,Vol.30,No.8率明显低于其他癌症患者。对于肺癌研究而言,仍需要不断研究肺癌发展的机制,探索化疗药物对肺癌的治疗作用2,而理想的肺癌动物模型是肺癌研究中的重要工具和研究桥梁。肺癌动物模型主要包括化学诱导模型、基因工程模型、移植瘤模型等。相较于前两种模型而言,肺癌移植瘤模型因具备制备周期短、重复性高、易于跟踪等优点,在研究中被广泛应用3。目前肺癌研究中应用较为常用的移植瘤疾病动物模型主要有两种,其一是肺癌的小鼠皮下移植瘤模型,另一种是经小鼠尾静脉注射形成的肺部转移瘤模型。前者操作简便,但是肿瘤发生发展脱离了肺部原本的微环境3。后者所构建的模型,相比于原发性肺癌的发生,更近似于模拟临床患者肿瘤的肺部转移而非发生情况。此外,尾静脉途径构建的肺转移瘤模型的肿瘤结节多而随机,难以对转移性肺肿瘤的发生发展过程进行跟踪和评价4。这两种模型在模拟临床肺癌病例时,均存在一定缺陷5。为了更好的模拟临床肺癌病例,直接将肿瘤定植于小鼠肺的造模方式应运而生,即肺癌原位移植瘤模型。原位移植瘤的造模方法主要包括通过气道移植和从胸骨外直接注射两种方式。由于缺乏精确定位,其肺癌造模结果依然存在肿瘤结节多发、不易准确跟踪的可能6-7。为了解决上述问题,我们对前人方法进行了改进,通过影像学 CT 确认模型所需进针深度及进针位置,采用立体定位仪,精确控制进针位置、进针深度与进针角度,使用微量注射器精确控制细胞注射体积,将肿瘤细胞直接接种于小鼠肺部,建立了一种小鼠肺癌原位移植瘤模型。相较于之前的模型研究,原位移植瘤模型具有原发于肺部、定植位置明确、肿瘤结节单发等优点,更贴近于临床患者肺癌的发生及发展,并可利用分子影像学技术对肿瘤发展过程进行示踪记录。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物6 只 6 周龄 SPF 级 C57BL/6J 雄性小鼠,体重16 18 g,购买自北京华阜康生物科技有限公司【SCXK(京)2019-0008】。饲养期间各组小鼠自由饮水,饲喂普通维持饲料由北京华阜康生物科技有限公司提供。饲养环境:昼夜各半循环照明,湿度恒定,温度控制在 22 25,饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所动物房【SYXK(京)2019-0039】。所有操作均符合中国医学科学院医学实验动物研究所伦理学要求(IACUC GR21003)。1.1.2 细胞LLC 小鼠肺癌细胞(国家实验细胞资源共享平台,中国)。1.1.3 主要试剂与仪器Luc 过表达慢病毒(吉凯基因,中国),0.25%胰酶-EDTA(Gibco,美国),PBS(Gibco,美国),Matrigel(BD,美国),D-Luciferin(泛博生化),CD3 抗体(abcam,ab16669),CD19 抗体(abcam,ab245235),F4/80 抗体(abcam,ab16911),Ly6G 抗体(abcam,ab25377),Ki-67 抗体(abcam,ab16667),CD31 抗体(CST,77699),-SMA 抗 体(abcam,ab124964),Vimentin 抗体(CST,5741S),E-cadherin 抗体(CST,14472S)。Inveon 微型 CT 扫描仪(西门子,德国),小鼠立体定位仪(正华生物,中国),30 g 微量注射器(Hamilton,美国)。1.2 方法1.2.1 荧光素酶报告基因细胞构建模型选用 LLC 小鼠肺癌细胞,购买自国家实验细胞资源共享平台,用含10%FBS 的 DMEM 培养基培养,培养条件 37,5%CO2。Luc 过表达慢病毒购买自上海吉凯基因医学科技股份有限公司,将LLC 细胞制备成浓度为 5104/mL 的细胞悬液,接种 2 mL 于 6 孔细胞培养板中,于 24 h 后进行慢病毒感染。慢病毒的转染严格按照吉凯基因慢病毒使用操作手册进行。病毒感染 72 h 后,用 6 g/mL puromycin 筛选细胞,并用 3 g/mL puromycin 维持培养。构建成为 LLC-luc 细胞。1.2.2 细胞注射悬液制备将 LLC-luc 细胞培养至汇合度达到 80%,用0.25%胰酶-EDTA(Gibco,美国)消化成为单细胞悬液。1200 r/min,5 min 离心后保留细胞沉淀,用PBS(Gibco,美国)吹洗 1 次再离心后,用预冷 PBS重悬计数,使细胞浓度达到 107/mL。Matrigel(BD,美国)提前置于 4融化,用预冷枪头按体积比 1 1与细胞悬液混合,制备成细胞注射悬液,置于冰上。1.2.3 肺原位移植瘤模型构建模型选用 C57BL/6J 小鼠。手术前用 1%戊巴比妥钠注射液麻醉,注射剂量 100 mg/kg。将小鼠左前肢腋下至肋骨下沿处皮肤备皮。小鼠向右侧面位放置于小鼠立体定位仪操作台面上,5601中国实验动物学报 2022 年 12 月第 30 卷第 8 期 Acta Lab Anim Sci Si