转基因抗虫作物鉴定质粒标准分子的构建与应用_王颢潜.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 1 期 83 89Current Biotechnology ISSN 2095-2341研究论文研究论文Articles转基因抗虫作物鉴定质粒标准分子的构建与应用王颢潜1，黄炎2，3，石雨婷4，朱鹏宇2，5，谢宇宙2，黄春蒙2，卢小雨6，付伟2，5*1.农业农村部科技发展中心，北京 100176；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；3.北京卫生职业学院，北京 101149；4.中国标准化协会，北京 100048；5.三亚中国检科院生物安全中心，海南 三亚 572025；6.深圳海关动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518038摘 要：苏云金芽胞杆菌基因是转基因抗虫作物中通用的外源功能基因，在绝大多数抗虫转基因作物中均有存在，然而Bt基因检测标准样品的缺乏却限制了我国转Bt基因抗虫作物检测工作的发展。为了弥补传统基体标准样品的缺失，首先将Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A 3种常用Bt外源基因克隆到pUC57质粒上，通过测序、酶切和qPCR等技术对质粒的序列和扩增功能进行了验证，然后对扩增效率和实际应用情况加以测试，评价其转基因检测的适用性，构建了质粒标准分子。结果显示，制备的质粒标准分子测序结果与靶标序列完全符合，酶切结果、qPCR扩增结果和扩增效率等均符合预期，在Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A基因特异性检测中的应用符合阳性对照要求，表明制备的阳性质粒标准分子能够作为转Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A基因qPCR基因特异性检测的阳性标准样品。关键词：转基因；Bt抗虫基因；质粒标准分子；基因特异性检测；qPCRDOI：10.19586/j.20952341.2022.0163 中图分类号：S476.2，Q78 文献标志码：AConstruction and Application of Reference Plasmids for Detection of Transgenic Insect-resistant CropsWANG Haoqian1，HUANG Yan2，3，SHI Yuting4，ZHU Pengyu2，5，XIE Yuzhou2，HUANG Chunmeng2，LU Xiaoyu6，FU Wei2，5*1.Development Center for Science and Technology，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100176，China；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China；3.Beijing Health Center Acadamy，Beijing 101149，China；4.China Association for Standardization，Beijing 100048，China；5.Chinese Academy of Inspection and Quarantine Center for Biosafety，Hainan Sanya 572025，China；6.Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Centre，Guangdong Shenzhen 518038，ChinaAbstract：The Bacillus thuringiensis gene is a universal foreign functional gene in transgenic insect-resistant crops.It exists in most insect-resistant transgenic crops.However，the lack of Bt gene detection standard materials limits the development of the detection on crops with transgenic insect-resistant Bt genes in China.In order to make up for the lack of traditional matrix standard materials，this experiment first cloned the three commonly used Bt foreign genes of Cry1Ab，Cry1Ac and Cry3A into the pUC57 plasmid，and carried out the sequence and amplification function of the plasmid by means of sequencing，enzyme digestion and qPCR.Validation，and then test the amplification efficiency and actual application conditions to evaluate the ap收稿日期：20220929；接受日期：20221107基金项目：海南省重大科技计划项目（ZDKJ202002）；中国检科院基本科研业务费（2020JK016）。联系方式：王颢潜 E-mail:；*通信作者 付伟 E-mail:生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnologyplicability of the genetically modified detection.The results showed that the sequencing results of the plasmid prepared in this study are in complete agreement with the target sequence，and the results of enzyme digestion，qPCR amplification results and amplification efficiency are all in line with expectations.The application in the specific detection of Cry1Ab，Cry1Ac and Cry3A gene events is in line with the positive control.The requirements indicated that the positive plasmid reference molecules prepared in this study can be used as positive reference materials for the specific detection of transgenic Cry1Ab，Cry1Ac and Cry3A gene qPCR events.Key words：transgene；Bt insect resistance gene；reference plasmids；gene-specific detection；qPCR苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）基因是常见的抗虫基因，存在于绝大多数的抗虫转基因作物中。自Bt抗虫基因被发现后，转Bt抗虫作物发展迅速，其中转Bt基因抗虫棉、抗虫大豆、抗虫玉米等转基因作物对抵抗害虫起到了巨大作用1-2。然而，随着转基因抗虫作物产业化应用步伐的加快，转基因生物安全监管任务面临着更大挑战，对转基因检测工作也提出了更高的要求。监管检测转基因抗虫作物的第一步就是对样品进行筛查，判断有无转基因成分。标准样品作为实物标准，对支撑检测工作的开展，确保检测结果的准确性、可靠性、有效性和可溯源性具有重要意义。转基因检测阳性标准样品的缺失将严重影响转基因产品的安全评价、身份验证、国内监管、进出口检验、企业自控和国际贸易互认等工作。近年来，国内外在转基因产品检测中质粒标准分子构建方面的相关研究非常活跃，已报道的转基因产品检测质粒标准分子覆盖了多数大规模商业化的转基因作物3。质粒分子标准样品由一种含有外源基因片段和内标准基因片段的质粒分子制备而成4。与传统的基体标准样品相比，质粒标准分子通过微生物进行存储和大量培养，不依赖原材料，质粒DNA容易提取且纯度较高，可有效地解决阳性标准品匮乏和制备困难的问题，给检测工作带来便利，因此，也常被科研工作者研制成转基因产品成分检测的阳性标准对照样品5。自2008年国家转基因生物新品种培育重大专项成立以来，我国作为转基因生物研发和应用的大国，也正式启动了转基因产品检测标准样品研究工作，发布了关于基体标准样品候选物鉴定方法以及制备技术的标准和规范，初步建立了质粒标准样品的制备技术，并开展了质粒和基体标准样品定值技术方面的研究6-8。目前，国内已经研制出针对转基因玉米、大豆、油菜、马铃薯、水稻等多种作物检测用标准样品/标准物质9-11。我国海关对转基因作物进口的相关法规较为严格，面对已经占据世界转基因作物市场且日益增加的转Bt基因作物，我国海关急需精确、简便的Bt基因检测手段，以便进一步加强我国对转Bt作物的监管。目前国内外所报道的针对Bt基因进行检测的阳性质粒标准分子主要是 Cry1Ab和Cry1Ac基因，这2个基因无法对现阶段常见的转基因品系进行覆盖。因此，开发覆盖Bt基因更多的Bt阳性质粒标准分子对于转Bt基因植物的检测具有重要的实际意义。本研究为满足境内转基因产品监管检测以及跨境转基因产品检测的需求，针对 3 种 Bt 基因Cry1Ab、Cry1Ac 和 Cry3A 检测时所需要的阳性对照需求，人工合成了3种Bt基因序列，将序列克隆到质粒载体上，得到了可同时满足定性检测转Cry1Ab、Cry1Ac和Cry3A 3种转基因外源基因成分的质粒标准分子。进一步验证质粒标准分子以及进行适用性分析，确保了本研究中Bt基因阳性标准样品能够满足转基因产品检测中的 Cry1Ab、Cry1Ac和 Cry3A基因 qPCR 筛选元件特异性检测的阳性对照需求。1材料与方法1.1实验仪器恒温摇床、恒温培养箱、台式高速离心机、Genegenius凝胶成像分析仪、Eppendorf高速冷冻离心机、Eppendorf紫外分光光度计、电泳槽、超净工作台、-70 超低温冰箱、涂布棒、剪刀、玻璃棒、天平、量筒、移液枪和温度计。1.2实验试剂LB 培养基、琼脂糖、100 mg mL-1氨苄青霉素、LB 液 体 培 养 基、10T4 DNA ligase buffer，2TaqMan universal master mix、EcoR V和Hind 限制性内切酶、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒、QIA84王颢潜，等：转基因抗虫作物鉴定质粒标准分子的构建与应用filter plasmid midi kits质粒提取试剂盒。1.3质粒DNA分子的构建和提取本研究以海关技术规范 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法（SN/T12042016）中 3 种 Bt 基 因 Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A作为构建标准质粒标准分子的靶标序列，将 3 种内标准基因的靶标序列拼接到一起，长328 bp，采用基因合成技术人工合成目的序列，然后将pUC57质粒用平端酶EcoR V酶切，通过平端连接克隆，构建了阳性质粒标准分子，最后将构建的质粒转入E.coli DH5感受态细胞中，便于保存与扩繁质粒DNA。1.4阳性质粒标准分子的验证1.4.1质粒DNA纯度与浓度测定通过紫外分光光度法（Nanodrop 2000）测定 pUC57-Cry 质粒DNA的A260/A280值。实验中质粒DNA的A260/A280应为1.82