2023年DNA与基因芯片（教学课件）.ppt

目目 录录 第第 二二 十十 一一 章章 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy 南方医科大学基因工程研究所南方医科大学基因工程研究所 郭秋野郭秋野 目目 录录 基因变异致病类型基因变异致病类型 内源基因的变异：内源基因的变异：基因结构突变基因结构突变 基因表达异常基因表达异常 外源基因的入侵：外源基因的入侵：基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗 遗传性疾病遗传性疾病 肿瘤、心脑血管病等肿瘤、心脑血管病等 生殖细胞生殖细胞 体细胞体细胞 病毒感染性疾病：病毒感染性疾病：HIVHIV、SARSSARS、HCVHCV、HPVHPV 目目 录录 第第 一一 节节 基基 因因 诊诊 断断 Genetic Diagnosis 目目 录录 特点：特点：针对性强：针对性强：病因学检测病因学检测 特异性强：特异性强：分子杂交技术分子杂交技术 灵敏度高：灵敏度高：PCRPCR、分子杂交放大效应，样品量少、分子杂交放大效应，样品量少 适应性强：适应性强：内源、外源基因内源、外源基因 早期快速诊断：早期快速诊断：一、基因诊断的概念和特点一、基因诊断的概念和特点 定义：定义：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。正常，从而对疾病作出诊断的方法。目目 录录 二、基因诊断常用技术方法二、基因诊断常用技术方法 一一核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 二二聚合酶链反响聚合酶链反响 (PCR)(PCR)三三基因测序基因测序 四四基因芯片基因芯片 目目 录录 二、基因诊断常用技术方法二、基因诊断常用技术方法 限制性内切酶谱分析法限制性内切酶谱分析法 DNA限制性长度多态性限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RLFP)间接间接分析分析 一一核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术原理：核酸分子杂交技术原理：目目 录录 核酸分子杂交的流程示意图 待测核酸制备待测核酸制备 滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化 杂杂 交交 去除未参与杂交的探针去除未参与杂交的探针 检检 测测 杂杂 交交 信信 号号 制备探针核酸片段制备探针核酸片段 探探 针针 标标 记记 参加标记核酸探针参加标记核酸探针 目目 录录 Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3 正常基因正常基因 5 3 突变基因突变基因 1.15kb 1.35kb 1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 0.2kb 正常正常 珠蛋白基因：珠蛋白基因：5CCTGAGG3 镰刀型贫血镰刀型贫血 ：5CCTGTGG3 目目 录录+0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人正常人 突变携带着突变携带着 患者患者 1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 目目 录录 DNA多态性多态性：中性突变导致个体间核苷酸序列的差异中性突变导致个体间核苷酸序列的差异 限制性长度多态性分析：限制性长度多态性分析：突变发生在酶切位点上，酶切突变发生在酶切位点上，酶切DNA片段不同长度片段不同长度 RFLP：孟德尔方式遗传，家族中，与某一疾病紧密连锁，孟德尔方式遗传，家族中，与某一疾病紧密连锁，作为遗传标志，判定家族成员是否携带致病基因作为遗传标志，判定家族成员是否携带致病基因 应用：应用：甲型血友病、囊性纤维病变、甲型血友病、囊性纤维病变、苯丙酮尿症苯丙酮尿症 2.DNA限制性长度多态性分析限制性长度多态性分析 目目 录录 RLFP分析法分析法 目目 录录 单基因病单基因病-苯丙酮尿症苯丙酮尿症I 型型 病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶Phenylalanina Hydrozylase,PAH缺乏。缺乏。主征：智力低下，尿有霉味主征：智力低下，尿有霉味 治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮食控制血中苯丙氨酸浓度，改善脑子的发育，食控制血中苯丙氨酸浓度，改善脑子的发育，而“危险期而“危险期一过，病婴后来就根本正常。一过，病婴后来就根本正常。PAHPAH仅存在于肝脏细胞中，在绒毛、羊仅存在于肝脏细胞中，在绒毛、羊水细胞和胎儿血中均不表达，故不能通水细胞和胎儿血中均不表达，故不能通过测定酶活力及代谢产物来进行过测定酶活力及代谢产物来进行PKUPKU的的产前诊断只能依赖于家系分析，找出与产前诊断只能依赖于家系分析，找出与PKUPKU致病基因相连锁的致病基因相连锁的RFLPRFLP，进行基因，进行基因分析做出产前诊断分析做出产前诊断 目目 录录 二二聚合酶链反响聚合酶链反响 polymerase chain reaction polymerase chain reaction PCRPCR PCRPCR定义：指由一对引物介导的基因或克隆定义：指由一对引物介导的基因或克隆的特定的特定DNADNA序列的酶促扩增的反响过程，是序列的酶促扩增的反响过程，是DNADNA的体外扩增技术，本质是的体外扩增技术，本质是DNADNA的体外复制。的体外复制。应用应用PCRPCR技术可以使特定的基因或技术可以使特定的基因或DNADNA片片段在短短的段在短短的2 23 3小时扩增至百万倍。小时扩增至百万倍。目目 录录 二二聚合酶链反响聚合酶链反响 Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize 目目 录录 PCR技术的根本原理技术的根本原理 模板模板DNADNA的变性：的变性：9494热变性，使热变性，使DNADNA双链解双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作准备；作准备；模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：5555左右，左右，引物与模板引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下，以聚合酶的作用下，以dNTPdNTP为反响原为反响原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板原理，合成一条新的与模板DNA DNA 链互补的半保链互补的半保存复制链存复制链 目目 录录 PCR产物以指数形式增加，即产物以指数形式增加，即Y=2n (n 为循环次数为循环次数)目目 录录 以爱滋病的临床以爱滋病的临床检测为例，简要检测为例，简要说明一下说明一下PCRPCR在在病毒感染的基因病毒感染的基因诊断中的应用。诊断中的应用。组织中总RNA的提取 利用反转录酶合成cDNA PCR反响：反响缓冲液 模板上述合成的cDNA 底物dATP,dGTP,dCTP,dTTP 引物爱滋病病毒特异性引物 TaqDNA聚合酶 50 l 循环：95，30sec变性 55，1min退火30循环 72，1min延伸 目目 录录 三三基因测序技术基因测序技术 他们给他们给DNA DNA 的测序带来了一场革命，分享了的测序带来了一场革命，分享了19801980年的诺年的诺贝尔化学奖。后来贝尔化学奖。后来SangerSanger法开展为自动化测序法，并为人法开展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越奉献。类基因组测序做出了卓越奉献。Fred Sanger Fred Sanger 创造的末端合成终止法创造的末端合成终止法 (sanger(sanger法法)Walter GilbertWalter Gilbert创造的化学裂解法创造的化学裂解法 MaxamMaxam-GillbertGillbert法法 目目 录录 末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理 2,3-双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸ddNTP与普通与普通dNTP不同不同 之处在于其脱氧核糖的之处在于其脱氧核糖的3位置少一个羟基，可在位置少一个羟基，可在DNA聚聚 合酶作用下通过其合酶作用下通过其5三磷酸基团掺入到正在增长的三磷酸基团掺入到正在增长的DNA 链中，但链中，但ddNTP因缺乏因缺乏3羟基而不能同后续的羟基而不能同后续的dNTP形成形成 磷酸二酯键，因此，当正在增长的磷酸二酯键，因此，当正在增长的DNA链末端碱基为链末端碱基为 ddNTP时，那么链延伸反响终止，不可能继续延伸。这样，时，那么链延伸反响终止，不可能继续延伸。这样，在在DNA合成反响混合物的合成反响混合物的4种普通种普通dNTP中参加少量的一中参加少量的一 种种ddNTP后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止 展开竞争，反响产物是一系列的核苷酸链，其长度取决展开竞争，反响产物是一系列的核苷酸链，其长度取决 于从用以起始于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终止的位合成引物末端到出现过早链终止的位 置之间的距离，结果将产生置之间的距离，结果将产生4类寡核苷酸，它们分别终止类寡核苷酸，它们分别终止 于模板链的每一个于模板链的每一个A、C、G或或T的位置上。的位置上。目目 录录 双脱氧链终止法的测序根底是以双脱氧核双脱氧链终止法的测序根底是以双脱氧核 苷三磷酸为循环测序反响的链终止剂。苷三磷酸为循环测序反响的链终止剂。目目 录录 P OH dNTP ddNTP P OH OH P P P P OH 末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理 目目 录录 5 3 5 3 引物引物 模板模板DNA dNTP DNA聚合酶聚合酶 ddATP ddTTP ddGTP ddCTP 末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理 目目 录录 末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理 目目 录录 目目 录录 DNA自动测序结果 目目 录录 四基因芯片技术 快速、高通量、平行化、自动化快速、高通量、平行化、自动化 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支持物外表，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息基因序列及表达的信息 目目 录录 四基因芯片技术 目目 录录 1.芯片的制备 Gene probes cDNA、DNA substrate Ready-to-use microarray Oligo probes A G C T or arrayer 目目 录录 Sample cells 1)Extract RNA or DNA 2)RT or PCR amplification 3)Fluorescent labeling Reference cells Sample ready combine Labeled RNA or DNA(Sample)Labeled RNA or DNA(Reference)2)1)3)1)2)3)2.基因表达谱双色标记 目目 录录 3.分子杂交 1)hybridize Apply sample 2)rinse 目目 录录 4.检测分析 Laser 1 Laser 2 Detector 1 Detector 2 Scanner 芯片的扫描 目目 录录 5.图 像 处 理 Detector 1 Detector 2 False-color differential image 目目 录录 图 像 分 析 基因诊断方法基因诊断方法 经典基因诊断经典基因诊断.限制性内切酶法限制性内切酶法.RFLP分析法分析法.寡核苷酸分析法寡核苷酸分析法 优点优点 缺点缺点.特异基因诊断特异基因诊断.未知基因诊断