2023年DCCIK细胞的制备及在肿瘤治疗中的应用（教学课件）.ppt

DCDC-CIKCIK细胞的制备及在肿瘤细胞的制备及在肿瘤治疗中的应用治疗中的应用 恶性肿瘤的治疗现状恶性肿瘤的治疗现状 恶性肿瘤恶性肿瘤 治愈治愈4545 难于治愈难于治愈5555 未缓解未缓解 缓解后复发缓解后复发 恶性肿瘤的多学科综合治疗恶性肿瘤的多学科综合治疗 恶性肿瘤各种治疗手段各具优势与缺乏恶性肿瘤各种治疗手段各具优势与缺乏 肿瘤外科学肿瘤外科学 肿瘤放射治疗学肿瘤放射治疗学 肿瘤化学治疗学肿瘤化学治疗学 肿瘤生物学治疗肿瘤生物学治疗 侧重点不同侧重点不同 局部与全身局部与全身 早、中、晚期早、中、晚期 肿瘤免疫学治疗的优点肿瘤免疫学治疗的优点 可以有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿可以有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞瘤细胞，到达治疗肿瘤到达治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的治肿瘤的目的。具有特异性强具有特异性强、适用性广适用性广、副作用轻等优点副作用轻等优点。肿瘤免疫学治疗肿瘤免疫学治疗 非特异免疫刺激剂及细胞因子治疗：非特异免疫刺激剂及细胞因子治疗：ILIL2 2、ILIL6 6、ILIL1212、GMGM-CSFCSF、TNFaTNFa、IFNaIFNa、IFNrIFNr等体内应用等体内应用，装装载有细胞因子基因的细胞治疗载有细胞因子基因的细胞治疗。治疗性疫苗：肿瘤抗原或多肽抗原疫苗治疗性疫苗：肿瘤抗原或多肽抗原疫苗、装载肿瘤装载肿瘤抗原基因的病毒疫苗抗原基因的病毒疫苗、基因修饰的肿瘤细胞疫苗基因修饰的肿瘤细胞疫苗、APCAPC细胞疫苗细胞疫苗、抗独特性疫苗抗独特性疫苗。MabMab导向治疗：导向治疗：MabMab、MabMab-毒素毒素、MabMab-同位素同位素、鼠鼠-人单抗人单抗、人源单抗人源单抗、双特异性抗体双特异性抗体。过继性免疫细胞治疗过继性免疫细胞治疗：供者淋巴细胞输注供者淋巴细胞输注、LAKLAK、TILTIL、CIKCIK、多种方法诱导的多种方法诱导的CTLCTL、DCDC-CIKCIK等等。过继免疫疗法过继免疫疗法 通过把在体外扩增的大量特异性效通过把在体外扩增的大量特异性效应细胞回输给患者后，产生直接杀应细胞回输给患者后，产生直接杀伤肿瘤细胞的作用。伤肿瘤细胞的作用。DCDC-CIKCIK培养及其应用培养及其应用 CIKCIK细胞：细胞：Cytokine Induced Killer CellCytokine Induced Killer Cell DCDC：Dendritic CellDendritic Cell CIKCIK细胞特性细胞特性 分布：肝脏和外周血分布：肝脏和外周血 来源：来源：CD3+CD56+TCD3+CD56+T细胞和细胞和CD4CD4-CD8+TCD8+T细胞细胞 一群以一群以CD3+CD56+TCD3+CD56+T为主的异质细胞包括为主的异质细胞包括/T T细细胞胞,/T T细胞细胞 与与LAKLAK、CD3AKCD3AK细胞相比高效、广谱杀伤、非细胞相比高效、广谱杀伤、非MHCMHC限限制制 DCDC与与T T细胞细胞 DCDC高表达高表达MHCMHC-类、类、类分子，类分子，MHCMHC分子分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽-MHCMHC分子复合物，递呈给分子复合物，递呈给T T细胞，从而启细胞，从而启动动MHCMHC-I I类限制性类限制性CTLCTL反响和反响和MHCMHC-类限类限制性的制性的CD4+ThlCD4+Thl反响反响 ；DCDC还通过其高表达的共刺激分子还通过其高表达的共刺激分子(B7(B7-1 1、B7B7-2 2等等)提供提供T T细胞活化所必须的第二信细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答。号，启动了免疫应答。DCDC负载肿瘤抗原负载肿瘤抗原 肿瘤杀伤作用肿瘤杀伤作用 DCDC在在DCDC-CIKCIK杀伤肿瘤细胞中的作用杀伤肿瘤细胞中的作用 诱导抗原特异性诱导抗原特异性CTLCTL反响反响 增加增加CIKCIK细胞的扩增倍数细胞的扩增倍数 增强增强CIKCIK肿瘤杀伤效力肿瘤杀伤效力 MHC：抗原提呈 自分泌细胞因子：INF,IL-12等 抑制CD4+CD25+调节T细胞生长 CIKCIK细胞的制备细胞的制备 PBMNC (CS3000 Plus)In a 3000ml Baxter bag Serum free culture medium IFN 第一天第一天 Il-2 第二天第二天 CD3 mAb 第二天第二天 IL 1 第二天第二天 14 days CSCS-30003000采集采集PBMNCPBMNC FicollFicoll别离别离PBMC,PBMC,洗洗2 2次次 1 1-2 2106106/ml/ml接种至含无血清培养基接种至含无血清培养基的培养袋中的培养袋中，10001000ml/ml/袋袋，参加参加IFNIFN-10001000U/mlU/ml，放置放置3737，5 5%的的COCO2 2孵箱孵箱中培养中培养2424h h 参加参加ILIL-1 1 100100U/LU/L，CDCD3 3单抗单抗5050ng/mlng/ml，重组人重组人ILIL-2 2 300300U/LU/L，继续继续培养培养，每每3 3天半量换液天半量换液，并补加并补加ILIL-2 2 300300U/mlU/ml。分别于第分别于第5 5，7 7，9 9天取细胞做细胞表天取细胞做细胞表型分析型分析FCMFCM检测检测，细胞杀伤实验细胞杀伤实验MTTMTT法法 收集细胞收集细胞，含含0 0.5 5%白蛋白的生理盐水白蛋白的生理盐水洗涤洗涤 回输回输 CD3CD3主要促主要促CIKCIK细胞增殖，促细胞增殖，促ILIL-2 2自分泌，也提高自分泌，也提高CIKCIK杀伤活性杀伤活性 IFNIFN-r/ILr/IL-1 1，上调细胞外表，上调细胞外表ILIL-2R2R表达，表达，IFNIFN-r r先于先于ILIL-2 2参加，有效激活效应细胞，增强抗肿参加，有效激活效应细胞，增强抗肿瘤活性瘤活性 DCDC的的培养培养 BMDC Serum free culture medium IL-4,GM-CSF TNF 成熟成熟DC 79 days IL-4,GM-CSF TNF PBDC Tumor antigen DCDC-CIKCIK共培养共培养 成熟成熟DC CIK细胞细胞+051 01 52 02 51234567 c e ll n u m b e rd a y sCIKCIK细胞的增殖细胞的增殖 02004006008001000FSC-Heightmajinlan070907d 9.003R1100101102103104CD3 PerCPmajinlan070907d 9.003R2100101102103104CD4 FITCmajinlan070907d 9.00302004006008001000FSC-Heightmajinlan070905d 6.003R1100101102103104CD3 PerCPmajinlan070905d 6.003R2100101102103104CD4 FITCmajinlan070905d 6.00302004006008001000FSC-Heightmajinlan070829d 0.001R1100101102103104CD3 PerCPmajinlan070829d 0.001R2100101102103104CD4 FITCmajinlan070829d 0.00162.%84.7%89.5%28.2%43.1%52.3%0122 53 03 54 04 55 05 56 06 5C y to to x ix ity%A M L A L LCIKCIK细胞对自体原代白血病细胞的细胞对自体原代白血病细胞的 杀伤作用杀伤作用 CIK细胞对自体原代白血病细胞有明显杀伤作用，且其细胞毒作用随着效靶比的增加而进一步增强，在效靶比为20：1时，其中位杀伤率分别为51.33%,52.95%1:51:1 01:2 001 02 03 04 05 06 0%c y to to x ic ityta rg e t:e ffe c to r ra tio A L L A M L N H L肿瘤细胞冻融物肿瘤细胞冻融物 肿瘤细胞坏死物肿瘤细胞坏死物 正常生长的肿瘤细胞正常生长的肿瘤细胞 无肿瘤细胞无肿瘤细胞 无无DC DCDC-CIKCIK对肿瘤杀伤作用对肿瘤杀伤作用 DCDC-CIKCIK对肝癌细胞的杀伤活性对肝癌细胞的杀伤活性 xDCxDC与与CIKCIK共培养后，共培养后，CIKCIK增殖能力和杀伤活性明显增强增殖能力和杀伤活性明显增强 DC/CIK治疗结肠癌血源性肺转移的实验研究治疗结肠癌血源性肺转移的实验研究 DCDC-CIKCIK治疗乳腺癌治疗乳腺癌 CIK/DCCIK/DC-CIKCIK治疗恶性血液病合并丙肝治疗恶性血液病合并丙肝 HCVHCV-RNARNA转阴例数转阴例数 14/1814/18 治疗治疗2 2疗程以上疗程以上HCVHCV-RNARNA持续阴性持续阴性 6/96/9 ALT/AST/TBILALT/AST/TBIL明显下降或正常例数明显下降或正常例数 10/1010/10 CIKCIK治疗治疗1 1例白血病合并丙肝后肝功的变化例白血病合并丙肝后肝功的变化 0 05050100100150150200200250250300300350350400400450450d0d0d1d1d4d4d7d7d14d14d22d22umol/Lumol/LALTASTTBIL新技术新技术 RetroNectin activated killer cellRAK DC相关的技术 RetroNectin activated killer cellRAK 重组人纤维蛋白片段(RetfoNectin)可参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。该产品已注册美国药典和国际专利。当包被在培养皿和培养瓶中时，RetroNectin能显著提高逆转录病毒转染入哺乳动物细胞内的效率。RetroNectin还可参与细胞的附着、伸展、分化和增殖，可增加体外CIK细胞扩增倍数，及肿瘤杀伤活性。RetroNectin activated killer cellRAK zoledronate acid/唑来膦酸 转染AFP质粒的腺病毒感染DC DC-CIK共培养 杀伤活性检测 健康供着DC和CIK 肝癌患者DC和CIK CIK/DCCIK/DC-CIKCIK治疗后的不良反响治疗后的不良反响 寒战寒战 发热发热 疲乏疲乏 无力无力 关节肌肉酸痛关节肌肉酸痛 一般一般2424小时内消失小时内消失 小小 结结 体外实验证实体外实验证实DC-CIK肿瘤杀伤活性强，并具有肿瘤特异肿瘤杀伤活性强，并具有肿瘤特异性；性；被认为是新一代免疫治疗的首选方案，已经进入被认为是新一代免疫治疗的首选方案，已经进入I、II期临期临床实验；床实验；临床实验时间短，病例数尚不多；临床实验时间短，病例数尚不多；治疗方案和标准尚待进一步标准和统一。治疗方案和标准尚待进一步标准和统一。