多棘海盘车多肽的制备及其抑制ACE活性研究_李敏晶.pdf

2023 年第 1 期摘要：采用酶解法制备多棘海盘车多肽，选取胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶分别酶解多棘海盘车的水溶性蛋白，获得多肽样品 PE-P、PA-P 和 AP-P。选取胰蛋白酶水解多棘海盘车的水溶性蛋白后再用质量分数为 30%，50%，80%的硫酸铵溶液分别沉淀出不同分子量范围的多肽样品 P-1，P-2 和 P-3。然后采用 HPLC 法分别测定上述多肽的血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性。结果表明，PE-P，PA-P 和 AP-P 均具有一定的抑制 ACE 活性，其中AP-P 的抑制活性最好，PA-P 次之，PE-P 最差，它们的 IC50值分别为 0.682 7，0.552 6，0.332 8 mg/mL。通过对P-1，P-2 和 P-3 分析结果可知，分子量越小的多肽对 ACE 的抑制活性越显著。关键词：多棘海盘车；多肽；血管紧张素转换酶（ACE）中图分类号：TQ936.16文献标志码：Adoi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2023.01.001Polypeptide of Asterias amurensis of Preparation and Research ofits Inhibitory Activity on ACELI Minjing，WANG Di，HU Lan，SUN Qing，LIU Shang，JIAO Yaqian（College of Marine Science and Environment，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023，China）Abstract：Polypeptide of Asterias amurensis was prepared by enzymolysis method.Pepsin，papain and alkaline protease wereselected to enzymolysis the water-soluble protein，and PE-P，PA-P and AP-P were obtained.Polypeptide samples of P-1，P-2 and P-3 with different molecular weight range were precipitated with 30%，50%and 80%ammonium sulfate.Then theACE inhibitory activities of the peptides were determined by HPLC.The results showed that PE-P，PA-P and AP-P were allhad certain inhibitory activity，among which AP-P had the best inhibitory activity，PA-P was the second，PE-P was theworst，and their IC50values were 0.682 7，0.552 6，0.332 8 mg/mL，respectively.The results of p-1，P-2 and P-3 showedthat the peptides with smaller molecular weight had more significant inhibitory activity on ACE.Key words：Asterias amurensis；peptide；angiotensin converting enzyme（ACE）多棘海盘车多肽的制备及其抑制 ACE 活性研究李敏晶，王迪，胡澜，孙庆，刘上，焦雅倩（大连海洋大学 海洋科技与环境学院，辽宁 大连116023）收稿日期：2022-03-02基金项目：辽宁省科技厅自然科学基金指导计划项目（20180550287）。作者简介：李敏晶（1976），女，博士，副教授，研究方向为天然产物化学。多棘海盘车（Asterias amurensis），是我国黄海沿岸一种十分常见的海星1，属于海洋无脊椎动物，棘皮动物门、海星纲、钳棘目、海盘车科、海盘车属2。多棘海盘车体呈五星型，口面平坦为浅黄色，反口面较隆起，表面为紫红色附有较多棘刺，是我国北方海洋海星的主要品种3。目前，国内外已有研究证明，海星中含有大量结构独特的具有生物活性的活性物质，如甾醇4-5、多糖6-8、蛋白质9、皂苷10-11、脂肪酸12及神经酰胺13等，但对于多棘海盘车中蛋白质、多肽及氨基酸等活性组分报道较为少见。近年来，生物活性肽因具有抑制高血压、抗凝血、抗肿瘤等多种生物活性而被广泛关注14。高血压是当今世界最常见的心血管疾病。据报道，全球约 1/3 的成年人口受到高血压的影响15，而与高血压治疗相关的全球每年直接医疗费用估计为3 700 亿美元16，而我国高血压患病率呈逐年增长态势，每 5 个成人中就有 1 人患高血压；目前全国高血压患者已超过 2 亿人。化学合成类降压药的种类主要有利尿剂、受体阻断剂、受体阻断剂、血管紧张素转换酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）抑制剂、钙通道阻滞剂等，已证明具有良好的降压效果。但化学合成类降压药具有明显的副作用，如头痛、水肿、低血压、心率过低、泌尿系统病变等等。因此，寻找来源于天然产物，具有明显降压效果且无副作用的降压活性成分势在必行。已有研究证明多棘海盘车中所含的组分具有多种多样的生物活性，如溶血、抗肿瘤、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、降血压、降血脂等作用17-26，由于海星基本不具有食用价值，海星活性物质这一研究领域在国内也属于偏冷的门类，研究还处于起步阶段。大连有文章编号：1671-9646（2023）01a-0001-04第 1 期（总第 567 期）农产品加工No.12023 年 1 月Farm Products ProcessingJan.农产品加工2023 年第 1 期优越的地理条件，拥有丰富的海洋生物多样性资源，因此对黄海产多棘海盘车中的多肽进行制备分离及抑制 ACE 活性研究，以期为海星资源的高值利用提供理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器海星，采自辽宁省大连黄海海域，经鉴定为多棘 海 盘 车（Asterias amurensis）；血 管 紧 张 素 酶（ACE，2.5 U）、马尿酰-组胺酰-亮氨酸（HHL）、马尿酸标准品（HIP），美国 Sigam 公司提供；卡托普利，修正药业集团提供；胃蛋白酶（13 000）；木瓜蛋白酶（2 000 U/mg）；碱性蛋白酶（200 U/mg）；胰蛋白酶（1250）；还原型谷胱甘肽（M=300）、氧化型谷胱甘肽（M=600）、维 B12（M=1 300）、细胞色素 C（M=12 500）、牛血清白蛋白（M=67 000）均为生物试剂；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；色谱实验用水为超纯水。Waters 600 高效液相色谱仪（包括 Waters 2478双波长检测器和 Empower 工作站），美国 Waters 公司产品；Kromasil C18色谱柱（5 m，I.D.4.6 mm250 mm）；BSA224S 型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；RE-52A 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品。1.2试验方法1.2.1多肽的制备多棘海盘车多肽的制备流程图见图 1。1.2.2ACE 抑制活性的测定（1）ACE 抑制活性的检测原理。ACE 酶在 37 条件下可以酶解 HHL 生成 HIP，HIP 在 228 nm 下会产生吸收。当被检测的样品具有抑制 ACE 活性时，HHL 的酶解反应会受到抑制，此时 HIP 的生成量减少。因此，可通过 HIP 含量的变化检测待测样品是否具有 ACE 抑制作用。（2）HPLC 测定条件。色谱柱：Agilent XBD C18（Agilent XBD C18），流动相：甲醇水=3070（含有 1 mL TFA、0.5 mL 冰乙酸），流速 1 mL/min，检测波长 228 nm，柱温 25。（3）标准曲线和保留时间的测定。取一定量的HIP 和 HHL 混合，摇匀后进样 20 L，检测 HIP 和HHL 的出峰时间。根据保留时间和峰面积配置 HIP的质量浓度分别为 0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 g/mL，依次进样 20 L，计算峰面积平均值，以峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标测定 HIP 标准曲线。（4）反应时间的确定。取 10 L 的硼砂缓冲溶液，加入 30 L 的 ACE，在 37 恒温条件下加入50 L 的 HHL 溶液，分别持续反应 10，20，30，40，50，60，80，100 min，然后加入 10 L 的 10%TFA 溶液终止反应。分别测定 HIP 的峰面积，平行测定 3 次，通过下式计算 ACE 抑制率（W）。W=A-BB100%.式中：W样品对 ACE 的抑制率，%；A不含抑制剂的 HIP 的峰面积，mAu；B含抑制剂的 HIP 的峰面积，mAu。（5）样品抑制 ACE 活性分析。取 10 L 样品，加入 30 L ACE，于 37 恒温条件下加入 50 L HHL，充分混合，于 37 下反应 40 min，加入 10 L 的10%TFA 溶液终止反应，按照 1.2.2（4）中的公式计算抑制率。（6）P-1、P-2、P-3 分子量和含量的测定。Sephadex G-25 标准曲线的绘制，在试验优化洗脱条件下，分别测定还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、维 B12、细胞色素 C、牛血清白蛋白 5 种分子量标准品在 Sephadex G-25 凝胶层析柱中的保留时间，以保留时间为横坐标，以标准品分子量的对数值为纵坐标绘制凝胶层析标准曲线图。含量与分子量的计算，在试验优化条件下对 P-1，P-2，P-3 分别进行Sephadex G-25 凝胶柱层析，测定保留时间洗脱曲线和峰面积，根据 Sephadex G-25 标准曲线和梯形面积计算法测定 3 种多肽样品的分子量和含量。2结果与分析2.1保留时间确定HPLC 色谱图见图 2。由图 2 可知，HIP 保留时间在 10 min 左右，HHL 在 100 min 左右，所以所选色谱条件下，HIP与 HHL 之间互不干扰，试验可行。采用试验色谱条件下测定 HIP 时，HIP 质量浓度与峰面积的线性关系良好，回归方程为 Y=11 239X-2 556.1，R2=0.999 1，最低检出限为 0.2 mg/mL，RSD 在 1.9%6.4%，说明图 1多棘海盘车多肽的制备流程图22023 年第 1 期图 2HPLC 色谱图该测定方法精密度良好。2.2反应时间的确定ACE 抑制活性反应时间确定见图 3。由图 3 可知，在 ACE 与底物 HHL 反应到 40 min时，HIP 的含量出现峰值，表明此时反应的活性最高。40 min 后的峰面积开始缓慢降低，反应 60 min后峰面积基本没有变化，表明在 60 min 后反应达到平衡。2.3AP-P，PA-P，PE-P 抑制 ACE 活性分析酶解所得 3 种多肽在相同条件下进行同质量浓度的活性检测，得到 ACE 抑制率结果。3 种酶解多肽的 ACE 活性抑制率曲线见图 4。由图 4 可知，碱性蛋白酶水解多棘海盘车蛋白得到的多肽 AP-P 的 ACE 抑制活性显著高于另外 2 种酶酶解所得的多肽。在 AP-P 的质量浓度达到 10 mg/mL 时对 ACE 的抑制率高达 95.88%。用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶水解多棘海盘车得到的多肽PA-P 和 PE-P 的 ACE 抑制率也很高，在试验最高质量浓度（10 mg/mL）对 ACE 的抑制率分别为 88.5%，86.1%。PA-P 和 PE-P 在质量浓度为 0.22.0 mg/mL时，其质量浓度与抑制率大致呈线性关系，当