儿童抗结核药物耐药比例法、...、全基因组测序检测对比研究_张颖.pdf

117 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023儿童抗结核药物耐药比例法、微孔板法、全基因组测序检测对比研究张 颖 任巧丽 赵瑞秋 许红梅 龙晓茹国家儿童健康与疾病临床医学研究中心 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿童感染免疫重庆市 重点实验室 重庆医科大学附属儿童医院感染科（重庆 400014）摘要：目的 探索微孔板法药物敏感性试验（DST）和全基因组测序（WGS）检测4种常用抗结核药物耐药性在儿科临床应用价值。方法 复苏培养阳性的结核分枝杆菌（MTB）保存菌株61株，分别行比例法、微孔板法和WGS检测异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素的耐药性。使用一致性检验检测微孔板法和WGS与比例法的一致性。结果 61株MTB菌株经比例法检测出48株（78.7%）全敏感菌株，13株（21.3%）对至少1种药物耐药，对4种药物共同耐药的3株（4.9%）。以比例法DST为金标准，微孔板法检测异烟肼耐药的敏感度、特异度和Kappa值分别为100.0%、92.0%和0.81，利福平分别为85.7%、98.2%和0.84，乙胺丁醇分别为0.0%、100.0%和0.00，链霉素分别为80.0%、98.0%和0.81；WGS检测异烟肼耐药的敏感度、特异度和Kappa值分别为90.9%、94.0%和0.79，利福平分别为100%、98.2%和0.92，乙胺丁醇分别为60.0%、94.6%和0.50，链霉素分别为80.0%、98.0%和0.81。结论 微孔板法和WGS对异烟肼、利福平和链霉素耐药检测均有较高的敏感度与特异度，与比例法结果高度一致，均可应用于临床。而对乙胺丁醇耐药性检测的一致性较差，建议使用比例法结合WGS结果来综合评判MTB乙胺丁醇的耐药性。关键词：全基因组测序；微孔板；一致性检验；最小抑菌浓度；儿童Comparison of the ratio method drug susceptibility test,micropore-plate method and whole-genome sequencing of anti-tuberculosis drugs in children ZHANG Ying,REN Qiaoli,ZHAO Ruiqiu,XU Hongmei,LONG Xiaoru(Department of Infection,Childrens Hospital of Chongqing Medical University,National Clinical Research Center for Child Health and Disorders,Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders.Chongqing Key Laboratory of Child Infection and Immunity,The Childrens Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing,400014,China)Abstract:Objective To explore the value of drug susceptibility test(DST)by micropore-plate method and whole-genome sequencing(WGS)in detecting the drug resistance of anti-tuberculosis drugs in children.Methods Sixty-one partially preserved strains with positive culture of Mycobacterium tuberculosis(MTB)were collected.The drug resistance of isoniazid,rifampicin,ethambutol,and streptomycin were detected by proportional method,micropore-plate method DST and WGS.The variants of four drug resistance related genes in WGS were summarized,and the clinical data,treatment plan and recovery of the affected children were collected.The reasons for the differences of drug resistance detected by the three methods were analyzed.Results Among 61 MTB strains,78.69%(n=48)were pan-susceptible strains,1.64%(n=1)was isoniazid-resistant strain,1.64%(n=1)was streptomycin resistant strain,6.56%(n=4)were isoniazid and streptomycin resistant strains,3.28%(n=2)were isoniazid,rifampicin,and ethambutol resistant strains,3.28%(n=2)were isoniazid,rifampicin and streptomycin resistant strains,and 4.92%(n=3)were resistant to the four drugs.The sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value,and the Kappa value of micropore-plate method for predicting isoniazid resistance were 100%,92.0%,73.3%,100%and 0.81,for rifampicin were 85.7%,98.2%,85.7%,98.2%and 0.84,for ethambutol were 0.0%,100%,0.0%,91.8%and 0.0,for streptomycin were 80.0%,98.0%,88.9%,96.2%and 0.81,doi:10.12372/jcp.2023.22e0083 论 著 基金项目：重庆医科大学附属儿童医院杰出青年人才基金（No.RC02017）；重庆市自然科学基金（No.CSTC2020JCYJ-MSXMX0580）；国家儿童健康与疾病临床医学中心临床医学研究项目（No.NCRCCH-2020-GP-06）通信作者：龙晓茹 电子信箱： 118 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023结核病仍是危害人类健康的感染性疾病1。据估计，2020年全球有990万人患有结核病，相当于每10万人口中有127例，其中11.0%为儿童2。2009年至2015年中国大陆31个省份上报至国家疾病控制中心的肺结核中，014岁儿童平均每年发病率为十万分之2.4，西部地区发病率最高3。儿童肺结核临床表现不典型，病原学阳性率低，易延误诊治4。虽然儿童耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）通常比成人有更好的治疗效果（儿童治愈率78.0%，成人为50.0%），但不足 5.0%的儿童接受了适当的治疗 5。因此，尽早明确儿童感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的耐药谱，选择合适治疗方案，提高治疗成功率，有利于儿童结核病的防控。本研究对比比例法、微孔板法和全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）3种方法用于异烟肼（isoniazid，INH）、利福平（rifampicin，RFP）、乙胺丁醇（ethambutol，EMB）和链霉素（streptomycin，SM）4种儿童常用抗结核药物耐药性检测的检验效能。1 材料与方法1.1 材料收集选取2015年10月至2020年9月在重庆医科大学附属儿童医院感染科化验室送检标本中分枝杆菌培养阳性的保存菌株87株，使用接种环接种到中性罗氏培养基上置于37 恒温培养箱中培养48周，共复苏成功61株。调取对应患儿的治疗方案与治疗结局，其中治疗结局根据世界卫生组织（WHO）2021年最新的结核病的治疗结局定义分为治疗成功组和治疗失败或死亡组6。1.2 方法1.2.1 表型药物敏感性试验 对所有成功复苏菌株分别采用比例法和微孔板法（试剂盒均购自珠海银科生物科技有限公司）行表型药物敏感性试验（drug susceptibility test，DST）及菌株鉴定。挑取罗氏固体培养基上培养的分枝杆菌菌落，移到含 0.5%吐温80的生理盐水试管中，使用细菌超声分散仪（购自广东体必康生物科技有限公司）分散菌落，配成1mg/mL的菌悬液。比例法DST：根据 结核病诊断实验室检验规程7，比浊后的菌悬液，在样本稀释瓶中利用含0.5%吐温80的生理盐水，把菌悬液稀释到10-2 mg/mL和10-4 mg/mL。采用标准接种环取0.01 mL，将两种浓度菌悬液分别接种到对照培养基及含药的罗氏培养基表面。置于斜面处37 培养，松开盖子，培养2448 h后，旋紧盖子继续培养46周。当对照中性罗氏培养基的菌体生长良好后，比较含药培养基和对照培养基上的菌落数，计算耐药百分比，耐药百分比1%报告耐药，否则为敏感。含药罗氏培养基的RFP浓度为 40 g/mL，INH为0.2 g/mL，EMB为2 g/mL，SM为4 g/mL7。使用含0.005 mg/mL的噻吩-2-羧酸肼（thiophene-2-carboxylic acid hydrazine，TCH）和0.5mg/mL的对硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）进行菌株鉴定，区分非结核分支杆菌和牛分枝杆菌。TCH生长为结核分枝杆菌复合群和非结核分支杆菌，TCH 未生长为牛分枝杆菌；PNB生长阳性提示非结核分枝杆菌，PNB未生长respectively.The sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value,and the Kappa value of WGS for predicting isoniazid resistance were 90.9%,94.0%,76.9%,97.9%and 0.79,for rifampicin were 100%,98.2%,87.5%,100%and 0.92,for ethambutol were 60.0%,94.6%,50.0%,96.4%and 0.50,for streptomycin were 80.0%,98.0%,88.9%,96.2%and 0.81,respectively.Conclusion Highly consistent with ratio method,micropore-plate method and WGS have higher sensitivity to predict isoniazid,rifampin,and streptomycin resistant tuberculosis in children,which can replac