恶性胸腔积液细胞游离miR...非小细胞肺癌患者生存的关系_况宇.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）恶性胸腔积液细胞游离miR-130a与非小细胞肺癌患者生存的关系*况宇1,2，宋胜军2，卢宗瑜2，何理2（1.湖北科技学院，咸宁437100；2.中国科学院大学重庆医院呼吸内科，重庆401120）摘要目的：分析恶性胸腔积液（MPE）中细胞游离miRNAs的表达及其与非小细胞肺癌（NSCLC）患者生存预后的关系。方法：收集2016年3月至2020年12月本院92例NSCLC患者的MPE样本，中位生存期为6个月，随机选择5例生存期6个月的患者和5例生存期6个月的患者，进行细胞游离miRNAs微阵列分析。使用定量RT-qPCR法对92例患者MPE样本进行miRNAs表达验证。采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析生存预测因素。结果：在生存期6个月和生存期6个月患者的MPE中，有33个miRNAs在微阵列中差异表达超过2倍，其中5个miRNAs表达水平（miR-130a、miR-345、miR-100、miR-24和miR-93）与总生存期显著相关。低miR-130a水平（中位值0.51）、低miR-100水平（中位值0.09）均与NSCLC患者较短的中位生存时间有关（P0.05）。多因素Cox回归分析显示：年龄（P=0.020）、miR-130a（P=0.001）和吸烟史（P=0.001）均为NSCLC患者生存的独立预测因素。结论：胸腔积液中miR-130a可以作为NSCLC患者总生存期的候选预测指标之一。关键词非小细胞肺癌；恶性胸腔积液；miRNAs；预后中图分类号：R473文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）12-2007-07DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2022.12.021Correlation between cell-free miR-130a in malignant pleural effusion and survival of patients with non-small cell lung cancerKuang Yu1,2,Song Shengjun2,Lu Zongyu2,He Li2.(1.Hubei Institute of Science and Technology,Xianning437100,China;2.Department of Respiratory Medicine,Chongqing hospital of Chinese Academy of Sciences,Chongqing 401120,China)AbstractObjective:To analyze the expression of cell-free miRNAs in malignant pleural effusion(MPE)andits relationship with the survival and prognosis of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods:MPE samples were collected from 92 NSCLC patients in our hospital from March 2016 to December 2020,witha median survival time of 6 months.Five patients with survival6 months and five patients with survival6months were randomly selected for cell-free miRNAs microarray analysis.The expression of miRNAs in 92 MPEsamples was verified by quantitative real-time reverse transcription-quantitative PCR(RT-qPCR).QuantitativeRT-PCR was used to verify the expression of miRNAs in 92 MPE patients.Univariate and multivariate Cox pro-portional hazard regression models were used to analyze the survival predictors.Results:Among MPE patientswith survival period 6 months and survival period 6 months,33 miRNAs were differentially expressed morethan twice in microarray,among which 5 miRNAs expression levels(miR-130a,miR-345,miR-100,miR-24 andmiR-93)were significantly correlated with overall survival.Both low miR-130a level(median 0.51)and low miR-100 level(median 0.09)were all related to the shorter median survival time of NSCLC patients(P0.05).Multi-variate Cox regression analysis showed that the age(P=0.020),miR-130a(P=0.001)and smoking history(P=0.001)were independent predictors of NSCLC patient survival.Conclusion:miR-130a in pleural effusion can beused as an effective predictor of the overall survival of NSCLC patients.Keywordsnon-small cell lung cancer;malignant pleural effusion;miRNAs;prognosis*基金项目：重庆市科技计划项目（No.20200293）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-08-18 2007广西医科大学学报2022 Dec；39（12）非小细胞肺癌（NSCLC）是世界范围内最主要的癌症死亡原因之一1。15%的NSCLC患者在初期诊断时可能已经伴有恶性胸腔积液（MPE），超过50%的患者在疾病晚期会出现MPE2。MPE中的肿瘤细胞增殖扩散是肿瘤转移的重要途径，也是NSCLC患者预后不良的主要标志物3。目前的标准治疗是最大限度地安全排出积液后，进行静脉化疗或胸腔热灌注化疗4。然而，并非所有患者都能从化疗中获益。因此，对患者进行预后评估对于选择更好的治疗方案至关重要。微小RNA（miRNAs）是1825个核苷酸的非编码RNA分子，可调节许多基因的表达，进而参与多种细胞生物学过程5-6。特异性miRNAs的异常表达与人类各种癌症的发病机制有关。一些报道表明，血清/血浆中可检测到游离miRNAs，可作为肺癌诊断和预后的可靠的生物标志物4-7。然而，目前尚未发现 MPE 中可以预测NSCLC患者临床预后的miRNAs信号。因此，本研究旨在明确 MPE 中的游离 miRNAs 是否可作为NSCLC患者生存的预测因素。1对象与方法1.1研究对象收集2016年3月至2020年12月本院92例NSCLC患者的MPE样本，其中男52例，女40例；年龄2987岁，中位年龄64.5岁；86例腺癌，4例腺鳞癌，2例鳞癌；临床分期B期29例，期63例；有吸烟史57例。病例纳入标准：（1）自愿参与本研究并已签署知情同意书；（2）组织学和（或）细胞学检查诊断为NSCLC；（3）采集标本前未进行胸腔用药。排除标准：（1）术前接受化疗者；（2）怀疑间质性肺炎或肺纤维化患者，合并其他严重器质性病变（如心肌梗死、心力衰竭、严重感染性疾病、严重肝肾衰竭）者；（3）有脑转移症状或合并其他恶性肿瘤者。所有患者均接受至少3个月的随访，除非死亡。在研究结束前，通过电话联系患者（或其家属）以评估生存状态或死亡日期。本研究已通过本院医学伦理委员会审核批准（审批号：L2016-23）。1.2样本采集和RNA分离收集患者5 mL MPE，用无RNase的含柠檬酸的试管提取RNA。4 000 r/min离心20 min，取上清液；将800 mL上清液与2.4 mLTRIzol LS试剂（美国Invitrogen）混合。每个样管再补充30 fmol的ath-miR159a。用miRNeasy Mini Kit（德国Qiagen）从MPE中提取包含小RNA的总RNA。1.3功能miRNAs的微阵列分析和生物信息学功能解释所有患者随访至2021年9月16日或死亡之日，绘制Kaplan-Meier生存曲线，中位生存期为6个月（133个月）。随机选择5例生存期6个月的患者（男4例，女1例，年龄5277岁，3例有吸烟史，均为腺癌，临床分期B 期 1 例、期 4 例）和5 例生存期6 个月的患者（男 3 例，女 2 例，年龄4473岁，2例有吸烟史，均为腺癌，临床分期B期3例、期2例）MPE样本，进行miRNA微阵列分析（美国Applied Biosystems）。两组患者在组织学类型和临床分期的概率上完全匹配，且年龄、吸烟情况和性别比较，差异无统计学意义（P0.05）。经过差异显著性分析和错误发现率（FDR，用BRB阵列工具计算）分析，根据P值阈值和倍数差异选择差异表达基因。根据NCBI的关键功能分类基因本体论（GO），分析差异表达基因的主要功能8。根据KEGG9，通过Pathway分析找出差异基因的显著通路。通过差异表达值统计miRNA与基因的关系，根据Sanger miRNA数据库10中miRNAs与基因的相互作用构建miRNAs-Gene网络。网络的中心用程度表示，这意味着 1 个 miRNAs 对周围基因的贡献。选择5个程度最高的miRNA作进一步研究。1.4定量 RT-PCR用 AMV 逆转录酶将 miRNAs逆转录为cDNA（日本Takara）。以总RNA（1.5 mL）为模板，16 孵育10 min，42 孵育40 min，70 孵育 15 min，使逆转录酶变性。应用 ABI SteponePlus检测系统（美国Applied Biosystems）使用UPL探针（瑞士Roche）对miRNAs进行定量PCR反应。PCR反应条件为95 变性10 min，随后95 退火15 s 和 60 延伸 1 min，循环 50 次。每个样本重复3次检测。为了确定用作参考基因的最稳定表达基因，我们检查了所选 miRNAs、两个小核 RNA（RNU6B和U6 snRNA）和两个小核仁RNA（RNU44和RNU48）的表达。U6 snRNA被确定为验证集中最稳定的参考基因；因此，miRNAs表达水平被标准化为 U6 snRNA 的水平。采用 2-CT法计算 miR-NAs相对表达量。1.5统计学方法使用SPSS 22.0统计软件对数据资料进行统计分析。非正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）M（P25P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料采用率或构成比表示，组间比较采用2检验或Fisher s精确检验。采用Kaplan-Meier法对NSCLC患者生存率进行估计并进行单因素分析，生存曲线采用Log-rank 2008检验，多因素分析采用Cox比例