2023年HBVcccDNA及其意义（教学课件）.ppt

HBVcccDNAHBVcccDNA及其意义及其意义 贵州省人民医院感染科贵州省人民医院感染科 汤正明汤正明 2022-08-15 1 2022.08.15 感感染染科科 2022-08-15 2 临床上我们常常遇到以下问题：临床上我们常常遇到以下问题：慢性乙肝难以治愈慢性乙肝难以治愈 抗病毒治疗过程中常常发生药物耐受抗病毒治疗过程中常常发生药物耐受 抗病毒治疗后容易复发抗病毒治疗后容易复发 分子生物学研究说明，分子生物学研究说明，HBVcccDNAHBVcccDNA在病毒持在病毒持 续感染、抗病毒治疗后的再度活泼复制以及药物续感染、抗病毒治疗后的再度活泼复制以及药物耐受方面起着至关重要的作用。耐受方面起着至关重要的作用。现就现就 HBVcccDNAHBVcccDNA乙肝病毒共价闭合环状乙肝病毒共价闭合环状DNADNA的研究进展进行简单的阐述。这是我的学习的研究进展进行简单的阐述。这是我的学习汇报，希望各位专家批评指正。汇报，希望各位专家批评指正。感染科感染科 为什么？为什么？2022-08-15 3 一、一、HBVHBV感染初期感染初期cccDNAcccDNA的形成的形成 二、二、HBVcccDNAHBVcccDNA的稳定性的稳定性 三、核苷类似物不能阻止初始三、核苷类似物不能阻止初始cccDNAcccDNA的形成的形成 四、四、HBVcccDNAHBVcccDNA检测方法检测方法 五、慢性乙肝患者五、慢性乙肝患者cccDNAcccDNA检测的意义检测的意义 六、如何去除六、如何去除HBVcccDNAHBVcccDNA？七、七、cccDNAcccDNA在抗病毒治疗研究中的应用前景在抗病毒治疗研究中的应用前景 一、一、HBVHBV感染初期感染初期cccDNAcccDNA的形成的形成 HBVcccDNAHBVcccDNA存在于肝细胞核内，是病毒成存在于肝细胞核内，是病毒成功感染肝细胞的标志，也是慢性乙型肝功感染肝细胞的标志，也是慢性乙型肝炎持久存在的关键。炎持久存在的关键。其形成过程包括：其形成过程包括：HBVHBV颗粒与肝细胞膜接触，被细胞以内颗粒与肝细胞膜接触，被细胞以内吞作用摄入，病毒脱壳后核壳体向肝细吞作用摄入，病毒脱壳后核壳体向肝细胞核转移，释放松弛的环状胞核转移，释放松弛的环状DNADNArelaxe relaxe circular DNA,rcDNA)circular DNA,rcDNA)进入细胞核。进入细胞核。2022-08-15 4 感染科感染科 2022-08-15 5 rcDNArcDNA的正链在的正链在DNADNA聚合酶作用下聚合酶作用下进一步延长形成全长的进一步延长形成全长的rcDNArcDNA，正，正负链末端各自连接并构象发生改负链末端各自连接并构象发生改变形成变形成cccDNAcccDNA，最后在核小体内，最后在核小体内组合形成非整合状态的微型染色组合形成非整合状态的微型染色体。体。感染科感染科 2022-08-15 6 细胞核内的细胞核内的cccDNAcccDNA作为复制模板作为复制模板转录前基因组转录前基因组RNARNA和其他基因的和其他基因的mRNAmRNA。前基因。前基因RNARNA被转运至胞浆，被转运至胞浆，与病毒核心蛋白以及与病毒核心蛋白以及P P蛋白组装成蛋白组装成核壳体。病毒核壳体。病毒DNADNA聚合酶具有逆转聚合酶具有逆转录酶活性，以前基因组录酶活性，以前基因组RNARNA为模板为模板逆转录子代逆转录子代DNA DNA，核壳体成熟。，核壳体成熟。感染科感染科 2022-08-15 7 成熟的核壳体有两个去向：成熟的核壳体有两个去向：局部再进入细胞核重新形成局部再进入细胞核重新形成cccDNAcccDNA，不断补充核内不断补充核内cccDNAcccDNA池；池；局部进入内质网与病毒蛋白组装成局部进入内质网与病毒蛋白组装成病毒颗粒向细胞外分泌，感染新的肝病毒颗粒向细胞外分泌，感染新的肝细胞。细胞。病毒病毒cccDNAcccDNA的产生也有两个途径，既的产生也有两个途径，既可由肝细胞内已有的病毒在复制周期可由肝细胞内已有的病毒在复制周期中产生，也可由新感染的肝细胞产生。中产生，也可由新感染的肝细胞产生。如下图。如下图。感染科感染科 2022-08-15 8 感染科感染科 2022-08-15 9 HBVHBV的复制的复制感染科感染科 HBVHBV复制过程复制过程 2022-08-15 10 感染科感染科 2022-08-15 11 复制方式：复制方式：HBV吸附吸附 cccDNA 转转 2.1KbmRNA 外衣壳蛋外衣壳蛋白白 录录 内衣壳蛋内衣壳蛋白白 3.5KbmRNA 前基因组前基因组 反转录反转录HBVDNA负链负链 复制复制+DNA 组装与组装与释放释放 感染科感染科 2022-08-15 12 动物实验证实，处于稳定感染的动物实验证实，处于稳定感染的肝细胞内大约有肝细胞内大约有3030-5050个个cccDNAcccDNA拷拷贝。对慢性乙型肝炎患者肝组织贝。对慢性乙型肝炎患者肝组织内内cccDNAcccDNA实时定量检测，平均每实时定量检测，平均每个感染细胞含有个感染细胞含有3333拷贝，与动物拷贝，与动物实验结果相符。实验结果相符。稳定感染的肝细胞核内稳定感染的肝细胞核内cccDNAcccDNA一一般维持在一定水平，既满足病毒般维持在一定水平，既满足病毒复制需要，又不对细胞产生毒性。复制需要，又不对细胞产生毒性。感染科感染科 2022-08-15 13 这一调节机制通过病毒胞膜蛋白这一调节机制通过病毒胞膜蛋白负反响机制来实现，前负反响机制来实现，前C C区蛋白发区蛋白发生变异可导致生变异可导致cccDNAcccDNA大量扩增，大量扩增，并引起细胞死亡。并引起细胞死亡。cccDNAcccDNA的稳定对维持细胞的长期的稳定对维持细胞的长期感染状态起决定作用。感染状态起决定作用。感染科感染科 2022-08-15 14 cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA在结构和理化特性在结构和理化特性上有上有3 3点不同：点不同：1.rcDNA1.rcDNA在正链与负链上均有缺口在正链与负链上均有缺口或缺刻，只是局部区域互补才能或缺刻，只是局部区域互补才能形成环状结构，但非超螺旋结构，形成环状结构，但非超螺旋结构，而而cccDNAcccDNA两条链均是完整的，两两条链均是完整的，两者共价互补，形成超螺旋结构。者共价互补，形成超螺旋结构。感染科感染科 2022-08-15 15 2.rcDNA 2.rcDNA 能与蛋白共价结合，能与蛋白共价结合，cccDNAcccDNA那么不能。那么不能。3.3.由于缺口或缺刻的存在，由于缺口或缺刻的存在，rcDNA rcDNA 可以被一些核酸酶降解成核苷酸可以被一些核酸酶降解成核苷酸或单核苷酸，而或单核苷酸，而cccDNAcccDNA那么由于那么由于是超螺旋且双链结构均完整，一是超螺旋且双链结构均完整，一般不会被上述酶降解。般不会被上述酶降解。感染科感染科 二二、HBVcccDNAHBVcccDNA的稳定性的稳定性 对对HBVcccDNAHBVcccDNA半衰期的认识来自动半衰期的认识来自动物实验。核苷类似物可以抑制胞物实验。核苷类似物可以抑制胞浆内病毒浆内病毒DNADNA的逆转录，从而阻断的逆转录，从而阻断胞浆内病毒胞浆内病毒DNADNA进入细胞核内再形进入细胞核内再形成成cccDNAcccDNA，使人们可以在动物实，使人们可以在动物实验模型中研究验模型中研究cccDNAcccDNA半衰期。半衰期。2022-08-15 16 感染科感染科 2022-08-15 17 AddissonAddisson研究发现，拉米夫定、研究发现，拉米夫定、双脱氧鸟苷前体联合抗病毒治疗双脱氧鸟苷前体联合抗病毒治疗能有效抑制能有效抑制DHBVDHBV的复制，的复制，1 1周后斑周后斑点杂交法检测说明，血清点杂交法检测说明，血清DHBVDNADHBVDNA下降至检测水平以下，肝组织中下降至检测水平以下，肝组织中cccDNAcccDNA呈指数下降，其半衰期为呈指数下降，其半衰期为3535-5757天。天。感染科感染科 2022-08-15 18 MoraledaMoraleda等通过土拨鼠原代细胞等通过土拨鼠原代细胞抗病毒研究结果显示，抗病毒研究结果显示，cccDNA cccDNA 的的半衰期很长，其去除依赖于感染半衰期很长，其去除依赖于感染细胞的死亡。细胞的死亡。但是也有相反的报道。但是也有相反的报道。尽管用人的原代肝细胞感染尽管用人的原代肝细胞感染HBVHBV，可以观察到可以观察到cccDNAcccDNA的合成和缓慢的合成和缓慢增加，但到目前为止还没有原代增加，但到目前为止还没有原代人肝细胞中人肝细胞中cccDNAcccDNA的半衰期的报的半衰期的报道。道。感染科感染科 三、核苷类似物不能阻止 初始cccDNAcccDNA的形成 DelmasDelmas等研究发现，阿德福韦能等研究发现，阿德福韦能降低培养细胞内降低培养细胞内DHBVDNA(DHBVDNA(包括包括cccDNA)cccDNA)水平，说明病毒感染后起水平，说明病毒感染后起始的病毒基因组向始的病毒基因组向cccDNAcccDNA的转换的转换在阿德福韦存在的情况下仍能发在阿德福韦存在的情况下仍能发生，但扩增合成生，但扩增合成cccDNAcccDNA的过程被的过程被抑制。抑制。2022-08-15 19 感染科感染科 2022-08-15 20 KockKock等研究发现，阿德福韦、拉等研究发现，阿德福韦、拉米夫定都可以局部抑制病毒感染米夫定都可以局部抑制病毒感染后初始的后初始的cccDNA cccDNA 转换，前者作用转换，前者作用更强，但是，即使联合用药也不更强，但是，即使联合用药也不能完全抑制初始能完全抑制初始cccDNA cccDNA 的转换。的转换。因此，说明抗病毒药物治疗期间因此，说明抗病毒药物治疗期间HBVHBV仍有能力感染新的肝细胞，给仍有能力感染新的肝细胞，给抗病毒治疗带来困难，因而对慢抗病毒治疗带来困难，因而对慢乙肝患者需要长期使用抗病毒药乙肝患者需要长期使用抗病毒药物治疗。物治疗。感染科感染科 四、四、HBVcccDNAHBVcccDNA检测方法检测方法 1.1.细胞内细胞内cccDNAcccDNA的抽提与纯化的抽提与纯化 最常用的抽提细胞内最常用的抽提细胞内cccDNAcccDNA的方法是蛋白质的方法是蛋白质去污剂沉淀法，其原理是基于去污剂沉淀法，其原理是基于rcDNArcDNA和和cccDNAcccDNA与蛋白质结合能力的差异。与蛋白质结合能力的差异。rcDNArcDNA能与蛋白质能与蛋白质共价结合，与绝大多数细胞染色体共价结合，与绝大多数细胞染色体DNADNA一起形一起形成沉淀，而成沉淀，而cccDNAcccDNA不能与蛋白质结合故游离于不能与蛋白质结合故游离于上清中，用酚氯仿抽提上清即可得到上清中，用酚氯仿抽提上清即可得到cccDNAcccDNA。根据缪晓辉等的经验，该方法的主要缺点是：根据缪晓辉等的经验，该方法的主要缺点是：抽提较为费时，一般需要抽提较为费时，一般需要4 4-5 5小时；酚氯仿抽小时；酚氯仿抽提环节多、得率不高；对于冻存的富集细胞提环节多、得率不高；对于冻存的富集细胞pelletpellet难以充分裂解，单裂解这一步可能难以充分裂解，单裂解这一步可能需要需要3 3-4 4小时甚至更长时间。此外，在上清中小时甚至更长时间。此外，在上清中实际仍然含有少量的实际仍然含有少量的rcDNArcDNA，而在沉淀中实际，而在沉淀中实际上也存在着一局部上也存在着一局部cccDNAcccDNA。2022-08-15 21 感染科感染科 2022-08-15 22 为进一步别离为进一步别离cccDNAcccDNA、rcDNArcDNA和单链和单链DNADNA，可以对抽提产物进行纯化。以酶切法最为可以对抽提产物进行纯化。以酶切法最为常用。外切核酸酶常用。外切核酸酶是