发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立_赵兴坤.pdf

第 卷第期 草地学报 年 月 ：发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立赵兴坤，孙昊，杨丽云，罗丽娟，刘攀道（海南大学热带作物学院，海南 海口 ；中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南 海口 ）摘要：细茎柱花草（）是圭亚那柱花草（.）的野生近缘种，具有茎秆直立、种子落粒性低、抗旱能力较强等特点。为开发一种高效的细茎柱花草毛状根转化体系，本研究以细茎柱花草子叶节为外植体及个发根农杆菌为供试菌种，探索菌液浓度、侵染时间、共培养时间对毛状根转化效率的影响。结果表明 为诱导毛状根发生的最优菌株，诱导率为 。其中，该菌株诱导毛状根产生的最佳条件为菌液浓度 、侵染时间为 、共培养，转化效率达 。同时，获得的转基因材料通过聚合酶链式反应（）和蛋白质免疫印迹（）分子鉴定方式，证实了外源基因已整合到细茎柱花草毛状根的基因组中。因此，本研究成功建立了一种细茎柱花草的毛状根转基因体系。关键词：细茎柱花草；子叶节；发根农杆菌；转基因；毛状根中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，）：.，.，.，.（），.：.；收稿日期：；修回日期：基金项目：海南省重点研发计划科技合作方向项目（）；海南省科协青年科技英才学术创新计划项目（）；海南省自然科学基金高层次人才项目（）；中国科协青年人才托举工程第五届项目（）资助作者简介：赵兴坤（），男，汉族，硕士研究生，主要从事热带牧草转基因技术研究，：；通信作者 ，：；柱花草属（）植物属于豆科蝶形花亚科，全属约有 个种，遗传多样性丰富，分布于美洲、非洲和东南亚，其起源中心为巴西和墨西哥。圭亚那柱花草（.）是目前世界范围内栽培面积最大的柱花草属植物，在热带与亚热带地区，既可作为物草种植，也可作为绿肥作物种草地学报第 卷植，用于提升土壤肥力和防止水土流失。圭亚那柱花草最早由中国热带农业科学院于 世纪八十年代引入我国，主要用作幼龄橡胶园的覆盖作物。随后，中国热带农业科学院又陆续从国际热带农业中心（）引进了圭亚那柱花草种质 余份，并利用这些种质为亲本培育了 个圭亚那柱花草的国家审定牧草品种，这些品种在海南、云南、贵州、广西、广东等省区已累计推广 多万公顷，圭亚那柱花草已成为我国最重要的热带豆科牧草之一。圭亚那柱花草相较于其他柱花草属植物具有产量高、粗蛋白含量高、饲用品质好、对酸性土壤逆境胁迫（低磷、铝毒害、锰毒害）的适应性好等优点，也存在茎秆匍匐、抗寒性低、落粒性强缺点，因此，利用与近缘种杂交的方式对圭亚那柱花草进行改良是今后柱花草育种的主要目标。细茎柱花草（.）在植物分类学上原被归为圭亚那柱花草的变种（.），后来被认定为一个新种。细茎柱花草与圭亚那柱花草在基因组分型上均为 型二倍体种，在目前发现的柱花草属植物中两者亲缘关系最近，可种间杂交（无生殖隔离）。作为圭亚那柱花草的野生近缘种，细茎柱花草因产量低、易感炭疽病、木质化程度高等缺点，未被驯化选育成牧草品种用于生产利用。但是，细茎柱花草也具有明显的优点，如抗旱能力较强、种子产量高（落粒性低）、茎秆直立利于机械化收割等特点。因此，细茎柱花草可作为改良现有柱花草品种的理想材料。发根农杆菌（）是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于土壤中，早在 世纪初科学家就发现其能诱导一部分植物产生毛状根，其携带 质粒中的 片段进入植物细胞并整合进植物基因组中，能刺激植物产生大量的毛状根，且产生的毛状根均由单个的细胞发育而来，遗传性状稳定，无嵌合体 。毛状根转基因技术已经在多种植物中被广泛应用，本文旨在利用发根农杆菌介导，建立一种适用于细茎柱花草的转基因毛状根体系，为今后的柱花草属植物的基因功能研究及生物育种提供技术储备。材料与方法 试验材料 植物材料与试剂本研究使用的细茎柱花草种子材料由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。抗体、山羊抗兔 抗体均采购于美国 公司。菌株与质粒发根农杆菌 ，和大肠杆菌 均采购于上海唯地生物技术有限公司；为常见的双元载体，该载体含有绿色荧光蛋白报告基因（），由本实验室保存并提供。试验方法 菌株的选择和活化选取种发根农杆菌菌株 、进 行 试 验。将种发根农杆菌在含有 链霉素的 固体培养基上划线，培养箱中培养。挑取单菌落分别接种于含有链霉素的 液体培养基中，下 培养。取 菌液转移至 含有链霉素的 液体培养基中，培养菌液 至，离心 ，弃上清，使用不含抗生素的 液体培养基重悬菌体，菌液用于侵染细茎柱花草外植体。载体质粒转入发根农杆菌采用冻融法将 质粒转入发根农杆菌 感受态。取 质粒加入 感受态中混匀，冰上静置 、液氮 、水浴 、冰浴 ，加入 无抗生素的 液体培养基，震荡培养，吸取 菌液涂布于含有 链霉素和 卡那霉素的 固体平板上 培养，挑取单克隆菌落，进行 鉴定，选择阳性克隆菌落保存，用于下一步转化柱花草。柱花草无菌苗的培育取适量的细茎柱花草种子去除外种皮，挑选完整饱满的种子放置于 离心管中，加入 去离子水，水浴 打破种子的休眠，于无菌工作台中吸取去离子水，的酒精浸泡，无菌水洗涤次，氯化汞溶液浸泡 ，无菌水洗涤次，置于无菌滤纸上吸干。将灭菌后的种子使用无菌的镊子接种于培养基上进行萌发。外植体的获得及毛状根的诱导使用已灭菌的镊子将萌发的无菌苗从培养基上取出，置于铺有无菌水浸湿滤纸的无菌培养皿上，使用无菌手术刀从柱花草子叶节下约 处切去下胚轴，再沿子叶节将两片子叶切开，同时在子叶上划出个伤口，即获得侵染所需的子叶外植体。将子叶外植体放入侵染液中侵染 ，用镊子将侵染后的外植体放至无菌滤纸上吸干多余菌液，置于 固体培养基上 暗培养；暗培养结束后使用第期赵兴坤等：发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立特美汀（）液体培养基清洗外植体，最后将外植体置于特美汀固体培养基上、光照条件下培养。图细茎柱花草子叶毛状根的诱导 注：，待转化细茎柱花草幼苗；，子叶外植体获取；，发根农杆菌侵染；，共培养；，毛状根诱导培养；，毛状根脱菌培养 ：；不同发根农杆菌侵染实验利用 的种发根农杆菌菌液分别侵染细茎柱花草的子叶外植体，诱导培养 天后统计毛状根的诱导率。本试验共个重复，每个重复 个子叶外植体。毛状根诱导率（）生根外植体数外植体总数 菌液浓度、侵染时间及共培养时间正交试验基于菌液浓度、侵染时间、共培养时间开展（）正交实验，菌液浓度分别设置为 ，；侵染时间设置为 ，；共培养时间设置为，。诱导 天后对毛状根进行形态检测，使用双波长便携式荧光蛋白激发光源（）观察并统计发绿色荧光的毛状根数目，计算毛状根转化率，同时对发绿色荧光的毛状根进行继代培养。毛状根转化率（）发绿色荧光根总数毛状根总数 转基因毛状根的 分子鉴定使用双波长便携式荧光蛋白激发光源观察 的表达情况，初步筛选出阳性毛状根。取 毛状根样品，液氮研磨，通过 法 提取 。以 为模板，通过四对基因特异引物进行 验证，其中 为发根农杆菌 质粒 插入区内的毛状根诱导基因，其上游引物为 （引物方向 ，下同），下游引物为 ，产物长度为 ；为 载体上 插入区内的绿色荧光蛋白基因，其上游引物为 ，下游引物为 ，产物长度为 ；为 载体上 插入区内的抗除草剂基因，其 上游引物为 ，下游引物为 ，产物长度为 ；（）为柱花草内参基因，其上游引物为 ，下 游 引 物 为 ，产物长度为 。蛋白质印迹法（）取 柱花草毛状根样品，液氮研磨后加入 ，水 浴 ，离心 ，取上清即为蛋白样品。取 样品进行 电泳，浓缩胶恒压 约 ，分离胶恒压 ，通过预染蛋白 确定电泳终止时间。采用湿转法将蛋白转移至 膜，恒压 约 。转膜结束后，膜用 清洗次，每次 ，清洗后加入 的脱脂牛奶封闭 。按照 的比例将 抗体加入到 的 脱脂牛奶中，摇床孵育过夜。用 清洗次，每次 以洗去未结合的抗体，按照 的比例稀释二抗，室温孵育 后用 清洗次。加入等比例显色液 和，利用 （美国）在化学发光下采集图像。数据处理采用 软件进行数据分析。结果与分析 不同发根农杆菌毛状根诱导效率的比较发根农杆菌 在侵染细茎柱花草子叶后，无法诱导产生毛状根（图）。发根农杆菌 和 的诱导效率均低于，而 的诱草地学报第 卷导效率高于。因此，发根农杆菌 是诱导细茎柱花草产生毛状根的最佳菌株，本研究选取该菌株进行后续试验。不同侵染条件对细茎柱花草毛状根转化率的影响在毛状根诱导 天后，将外植体在绿色荧光蛋白激发光源下观察发光情况并记录。图所示，新生的毛状根在激发光下观察到绿色荧光，证明外源基因成功转入。对正交试验结果（表）进行分析可知，在试验处理水平的选择范围内，菌液浓度对于转化效率的影响最大，极差为 ，其次为共培养时间，而农杆菌侵染时间对于转化效率的影响最小。最优组合菌液浓度为，侵染 ，共培养，转化效率最高为 。图不同发根农杆菌菌株毛状根诱导效率的比较 注：图中不同字母表示不同菌株间差异显著（）：（）图毛状根荧光检测 注：，明场下的转基因毛状根；，转基因毛状根荧光检测；，明场下的未转基因根；，未转基因根荧光检测 ：；表不同侵染条件对毛状根转化效率的影响 编号 菌液浓度 侵染时间 共培养时间 转化效率 注：和表示转化效率在各因素不同处理水平下的总值和平均数；表示转化效率的极差；表中各数据为每个处理的平均值标准误，列内不同小写字母表示每个因素各水平间差异达显著水平（）：；，（）第期赵兴坤等：发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立 转基因毛状根的鉴定为进一步验证发根农杆菌的相关基因以及植物表达载体 是否成功整合到细茎柱花草毛状根的基因组，以个发绿色荧光毛状根的基因组 为模板利用 技术检测 ，基因，以野生型柱花草根系基因组和 作为阴性对照模板，以转入 质粒的 菌 液 作 为 阳 性 对 照 模 板。图 可 知，和阳性对照未扩增出 片段，而在个柱花草根系样品中均扩增出 条带且大小一致，表明样品可靠。个转基因毛状根中均扩增出 ，条带且与阳性对照条带大小一致，阴 性 对 照 未 扩 增 出 条 带，表 明 ，均成功整合到细茎柱花草毛状根基因组中。此外，利用 对这个转基因毛状根中 的表达进行蛋白水平的鉴定，用野生型柱花草根系作为阴性对照。图 可知，个转基因毛状根样品均有明显条带条带大小正确，且阴性对照未出现条带，表明 在柱花草毛状根中正常表达。图转化毛状根的分子检测 注：，转化毛状根 检测；，野生型柱花草根系；，；，转入 质粒的 菌液，转 基因毛状根株系；，：转化毛状根 检测；：野生型柱花草根系；：转 基因毛状根株系；：；：讨论在发根农杆菌介导的毛状根转化体系中，毛状根的诱导效率和转化效率受到菌株类型、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等多种因素的影响。本研究发现在诱导细茎柱花草产生毛状根时，不同发根农杆菌菌株诱导产生毛状根的效率存在显著差异。菌株 无法诱导细茎柱花草产生毛状根，这与在白花草木樨、小扁豆、白羽扇豆 等豆科植物中的研究结果存在差异，这可能与物种之间的差异有关。，这种均能诱导细茎柱花草产生毛状根，其中 菌株的诱导能力显著高于其它两个菌株，且毛状根生长状态良好，因此，是最适用于细茎柱花草毛状根转化体系建立的菌株。罗萍等 发现 菌株对尾巨桉的毛状根诱导率高达 ，这与本试验研究结果一致。侵染所用的菌液浓度、侵染时间、共培养时间也是影响毛状根的转化效率的重要因素。本研究结果表明，菌液 为、侵染时间为 以及共培养时毛状根转化效率最高，是发根农杆菌诱导细茎柱花草子叶产生毛状根时最佳侵染条件（表）。过高的菌液浓度和较长的侵染时间都会降低毛状根的转化效率，这可能是发根农杆菌大量附着在细茎柱花草子叶表面，后期共培养阶段菌大量繁殖，导致子叶褐化死亡，无法诱导产生较多毛状根。确定合适的筛选压是成功获得植物转基因材料的关键步骤，对转化效率有极大影响。本试验参照本草地学报第 卷课题组前期实验结果，选择 进行筛选，获得了 的转化效率，转化效率仍待进一步提高。周玲燕等 研究发现在水稻的转基因过程中使用潮霉素作为筛选剂优于 ，具有较少的假阳性，能显著提高阳性率。韩秀丽等 在大麦的遗传转化研究中也发现潮霉素较草丁膦更适于作为筛选剂。因此，为进一步提高转化效率，减少假阳性，后续研究可使用不同的筛选剂，确定