独活化学成分及抗骨质疏松活性评价_曹刘丹.pdf

质网途径。在线粒体调节通路中 蛋白家族是重要的调节因子，可分为凋亡抑制蛋白和促凋亡蛋白两大类。和 分别是 蛋白家族中典型的凋亡抑制蛋白和促细胞凋亡蛋白，两者的比值（）成为“凋亡开关”，决定细胞是否进入凋亡状态。在线粒体调节途径中，线粒体细胞色素（）释放到胞质中，与 形成凋亡小体，使 前体（）被催化形成有活性的 ，继而被激活的 激活效应酶 ，最终诱导凋亡。此外，作为重要的细胞凋亡调控蛋白，可通过上调 的表达及下调 的表达共同完成促进细胞凋亡的作用，同时还可促进周期蛋白依赖性激酶抑制因子的表达引起细胞 期阻滞。本实验通过蛋白免疫印迹法检测 细胞中上述的凋亡相关蛋白的表达情况，结果显示，作用于 细胞后，线粒体介导的凋亡通路所涉及的一系列信号分子出现浓度依赖性的明显变化，即促凋亡蛋白 和 的表达增加、凋亡抑制蛋白 的达减少、线粒体内凋亡因子 的表达增加、线粒体通路下游的 和 被剪切活化。这些结果表明，线粒体通路可能参与调节 诱导 细胞凋亡的作用。综上所述，发酵的桦褐孔菌（）对人肝癌 细胞具有显著的增殖抑制和诱导凋亡的作用，且线粒体介导的凋亡通路可能参与其中，但 对其他凋亡途径的作用及机制有待于进一步研究。参考文献：李 青 桦褐孔菌多糖的提取、纯化及其抗肿瘤活性研究 青岛科技大学硕士学位论文，戚月婷，玄光善 桦褐孔菌总三萜提取工艺的研究 应用化工，（）：，（）：，：马伟平，侯睿，王昊月，等 发酵桦褐孔菌诱导肝癌 细胞的凋亡作用 医学研究生报，（）：王李俊，杨 琴，王飞，等 桦褐孔菌醇诱导人乳腺癌 细胞凋亡的分子机制研究 中草药，（）：，（）：，（），（）：，：张振宇，田雪梅，卜祥辉，等 桦褐孔菌提取物体外抗肿瘤作用研究 中国菌物学会学术年会论文集，年 李 敏，林 俊 细胞凋亡途径及其机制 国际妇产科学杂志，（）：许 慧 莲房原花青素诱导 积蓄介导 细胞自噬和凋亡的研究 江苏大学硕士学位论文，：，：收稿日期：；修订日期：基金项目：广东省自然科学基金（）作者简介：曹刘丹（），女（汉族），河南商丘人，广东药科大学中药学院在读硕士研究生，主要从事中药的应用开发研究工作通讯作者简介：李 钟（），女（汉族），湖南衡阳人，广东药科大学副教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事中药资源开发与品质评价研究工作通讯作者简介：田素英（），女（汉族），河南商丘人，广东药科大学副教授，硕士学位，主要从事中药的应用开发与教学工作独活化学成分及抗骨质疏松活性评价曹刘丹，胡 晨，顾 琼，何 琳，滕希峰，田素英，李 钟，（广东药科大学中药学院，广东 广州；中山大学药学院，广东 广州；广东药科大学广东省化妆品工程技术研究中心，广东 中山；国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室，广东 广州；）摘要：目的 研究独活（）根的化学成分及其抗骨质疏松活性。方法 采用硅胶、等层析柱及半制备高效液相色谱对独活根部分 乙醇提取物进行分离纯化，通过核磁共振波谱、质谱以及与文献数据比较，进行结构鉴定。结果 从独活中分离得到 个化合物，分别鉴定为蛇床子素（），（），欧芹酚（），（），补骨脂素（），香柑内酯（），氧化前胡素水合物（），（）（），二氢欧山芹醇乙酸酯（），二氢欧山芹素（），二氢欧山芹醇（），（），当归醇（），（），没药当归烯酮（），（），（，），（），（，），（），十八烷二烯酸甲脂（）和（）。结论 化合物，和 为首次从该植物中分离得到。对 个化合物进行抗骨质疏松活性筛选，发现 个化合物（，和）具有显著抑制 诱导破骨细胞分化的活性。关键词：独活；香豆素；分离鉴定；破骨细胞 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）时珍国医国药 年第 卷第 期 ，（，；，；，；，）：，（），（），（），（），（），（），（），（）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（，），（），（，），（），（），（），：；独活（）别名川独活、肉独活等，是伞形科植物重齿毛当归（）的干燥根，主要分布于四川、湖北等地，生长在山坡阴湿的灌丛林下，。药材呈圆柱形，有特异香气，其味苦辛、微温，归肾、膀胱经，有祛湿止痛的功效，主治风寒湿痹，腰膝酸痛。独活中的化学成分主要含有香豆素类、挥发油类、以及少量甾醇和糖类。现代药理研究表明，独活具有抗炎、镇痛、抗心律失常和抗氧化等药理活性。等研究发现，独活中的蛇床子素可通过 途径促进大鼠颅骨成骨细胞的成骨分化。但是，至今未见对独活进行系统的抗骨质疏松活性物质基础研究。本文对独活根部分进行了化学成分研究，并从中提取分离得到了 个化合物，分别鉴定为蛇床子素（），（），欧芹酚（），（），补骨脂素（），香柑内酯（），氧化前胡素水合物（），（），），二氢欧山芹醇乙酸酯（），二氢欧山芹素（），二氢欧山芹醇（），（），当归醇（），（），没药当归烯酮（），（），（，），（），（，），（），十八烷二烯酸甲脂（）和（）。化合物，和 为首次从该植物中分离得到（图）。对 个化合物进行抗骨质疏松活性筛选，发现 个化合物（，和）具有抑制 诱导破骨细胞分化的活性。仪器与材料 型，型超导核磁共振仪（德国，内标）；柱色谱硅胶（目，目，青岛海洋化工有限公司）；薄层层析正相硅胶板（青岛海洋化工有限公司）；反相柱色谱 （，）；（瑞典 ）；型高效液相色谱仪（日本）；液相色谱 质谱联用仪（美国）；显色剂（的硫酸乙醇溶液）；石油醚、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷等试剂为市售分析纯（安耐吉化学）。胎牛血清（美国）；双抗（美国）；（中山大学药学院分子设计中心）；多聚甲醛（）；（上海碧云天生物科技有限公司）；培养基（美国）；培养基（美国）；巨噬细胞集落刺激因子（）；染色试剂盒（美国 ），（德国）。小鼠骨髓源巨噬细胞（，）分离于 小鼠双侧股骨与胫骨的骨髓；小鼠单核巨噬细胞（）复苏自本实验室。实验药材于 年 月采购于广州市清平药材市场，经中山大学药学院顾琼副教授鉴定为独活（），标本（编号：）存放于中山大学药学院。方法与结果 提提取取与与分分离离 取独活，粉碎成粗粉，以 倍量乙醇为溶剂，采用冷浸法提取 次，每次，过滤合并提取液并减压浓缩得浸膏。将浸膏加水分散后，用乙酸乙酯萃取 次，回收萃取液，浓缩得到萃取物。乙酸乙酯萃取物（）经硅胶柱色谱（目），以石油醚 乙酸乙酯为溶剂（，），进行梯度洗脱，得到 个组分（）。（）重结晶得到化合物（）。（）采用硅胶柱层析分离，以石油醚 乙酸乙酯（）为洗脱剂，进行梯度洗脱，得到化合物（）。（）采用硅胶柱层析分离，石油醚乙酸乙酯（，）体系梯度洗脱，得到 个组分（）。其中 （）再经 柱层析纯化，得到化合物（）。（）经 柱层析纯化，氯仿甲醇（，）洗脱，得到 个组分（）。（）采用硅胶柱层析分离，石油醚 二氯甲烷 乙酸乙酯（）等度洗脱，得到化合物（），（）和（）。（）经 柱层析纯化，氯仿 甲醇（）洗脱，得到化合物（）和（）。（）以甲醇 水为溶剂（，）经 柱层析，进行梯度洗脱，得到 个组分（）。经高效液相色谱仪（）纯化甲醇 水（，）得到化合物（），（），（）和（）。（）采用硅胶柱层析分离，石油醚 二氯甲烷（，）体系梯度洗脱，得到 个组分（）。（）经 柱层析纯化，氯仿 甲醇（）洗脱，得到化合物（），（），（）和（）。（）采用硅胶柱层析分离，石油醚 乙酸乙酯（，）体系梯度洗脱，得到化合物（），（）和（）。（）采用硅胶柱层析分离，二氯甲烷 乙酸乙酯（，）体系等度洗脱，得到化合物（）。结结构构鉴鉴定定 化化合合物物 白色晶体，。（，）：（，），时珍国医国药 年第 卷第 期（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为蛇床子素。化化合合物物 白色粉末，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为。化化合合物物 白色粉末，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为欧芹酚。化化合合物物 浅黄色针晶，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为。化化合合物物 白色结晶，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为补骨脂素。化化合合物物 白色结晶，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为香柑内酯。化化合合物物 白色粉末，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为氧化前胡素水合物。化化合合物物 白色针晶，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为（）。化化合合物物 白色固体，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为二氢欧山芹醇乙酸酯。化化合合物物 白色固体，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为二氢欧山芹素。化化合合物物 白色固体，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为二氢欧山芹醇。化化合合物物 白色粉末，。（，）：（，），时珍国医国药 年第 卷第 期 （，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为。化化合合物物 白色针晶，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为当归醇。化化合合物物 白色针晶，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（，），（），（），（），（，），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献报道一致，故确定化合物 为。化化合合物物 黄色针晶，。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文