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啶虫脒
小鼠
睾丸
间质
细胞
活力
影响
及其
机制
探讨
刘芙
实验研究啶虫脒对小鼠睾丸间质细胞活力、凋亡的影响及其机制探讨刘芙,王鑫,袁宁,马跃,马明月,毛亚萍(通信作者)沈阳医学院公共卫生学院卫生检验学教研室,辽宁 ;沈阳医学院公共卫生学院毒理学教研室基金项目:国 家 级 大 学 生 创 新 创 业 训 练 计 划 项 目(;);环境与儿童健康教育部和上海市重点实验室开放项目()作者简介:刘芙(),女,在读本科生,卫生检验与检疫专业,研究方向:啶虫脒致生殖毒性机制研究通信作者:毛亚萍,:摘要:目的探讨啶虫脒()对小鼠睾丸间质细胞 的活力、凋亡的影响及其作用机制,为 生殖毒性及机制研究提供线索。方法以、分别加入小鼠睾丸间质细胞 细胞(、组)中作用,法检测细胞活力,检测 、及磷脂酰肌醇激酶()、蛋白激酶()、叉头框蛋白()。结果与 组比较,、组细胞存活率均降低,差异有统计学意义(均 )。与 组比较,、组 升高,、组 、升高(均 )。与 组比较,、组 升高(分别为 、,均 ),、组 升高(分别为 、,均 ),、组 升高(均 )。结论 可导致 细胞活力降低,剂量越高作用越强;低剂量 可促进 细胞凋亡,高剂量 可抑制细胞凋亡;高剂量 可能通过调控 信号通路发挥抗凋亡作用。关键词:啶虫脒;新烟碱类杀虫剂;睾丸间质细胞;生殖毒性;细胞活力;细胞凋亡 :中图分类号:文献标识码:文章编号:(),;,:(),(,),(),(),(,),(,),(),:;啶虫脒()是应用最广泛的新烟碱类杀虫剂()之一,通过选择性作用于烟碱型乙酰胆碱受体(),导致昆虫因异常兴奋而死亡。大量应用导致的环境问题日益凸显。一项关于中国成年人饮食 暴露情况调查显示,饮食样本中 种 被检测到,其中 和吡虫啉()检测率较高。一项对我国 个城市共 份尿液样品中 的检测结果显示,尿液中 检出率为 以上,表 明 广 泛 应 用 导 致 了 人 群 的 普 遍 暴露。近年,对哺乳动物的生殖毒性已成为研究重点。动物实验研究发现,暴露可导致雄性大鼠血浆睾酮浓度和精子质量显著下降,睾酮合成关键预防医学论坛 年月第 卷第期 ,基因 、表达下调,从而损害大鼠生殖能力。但目前 对生殖系统毒性作用的研究较少,相关机制并不明确。年 月,本研究利用小鼠睾丸间质细胞 ,在体外探究 对细胞活力、凋亡的影响及其作用机制,为 致生殖毒性机制研究提供线索和理论基础。材料与方法 材料小鼠睾丸间质细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心),(纯度)(,中国),培养基、胎牛血清(,美国),、胰酶、青霉素 链霉素(双抗,美国),(诺唯赞,中国),(生工生物,中国),()、(,日本)等。细胞培养及 干预应用 培养基(含 和双抗)培养 细胞。称取一定重量的 ,溶于,再将其进一步溶于相应体积的 培养基中,配制成浓度为、的 溶液(终浓度不超过 )。将不同浓度 溶液分别加入 细胞(、组)。细胞活力的检测采用 法。细胞接种于 孔板,待细胞量长至约,分别将、加入 细胞,弃去旧培养液,每孔加入 溶液和 培养液,混匀,于 继续培养,利用酶标仪于 波长处测吸光度()值,计算细胞存活率。细胞 、及细胞磷脂酰肌醇激酶()、蛋白激酶()、叉头框蛋白()相对表达量的检测 采用 法。细胞接种于孔板,待细胞量长至约,将、分别加入 细胞。用 法提取总 ,测定 浓度,取为 模 板 进 行 反 转 录(),反 转录的 再 用 ()进行 分析。所用基因 引 物 如 下:上 游 引 物 ,下 游 引 物 ;上 游 引 物 ,下 游 引 物 ;上 游引 物 ,下游引物 ;上 游 引 物 ,下 游 引 物 ;上游引物 ,下游引物 ;上游引物 ,下游引物 ;上游 引 物 ,下游 引 物 。反应条件为:预变性 ,变性 及退火延伸 共 个循环。反应结束后,以 为内参基因,采用 法计算目的基因 相对表达量。统计学处理采用 软件进行统计分析。所有数据来源于个独立重复实验,计量数据用?表示,组间比较采用 检验。为差异有统计学意义。结果 不同浓度 加入后 细胞活力、组 细 胞 存 活 率 分 别 为 、。与 组比较,、组细胞存活率均降低,差异有统计学意义(分别为 、,均 )。不同浓度 加入后 细胞凋亡情况与 组比较,、组 升高(分别为 、,均 ),、组 升高(分别为 、,均 )、升高(分别为 、,均 ),升 高(分 别 为 、,均 )。见表。表各组 细胞 、表达比较(?)组别 组 组 组 组 组 注:与 组比较,。加 入 后 细 胞 活 力 、变化 与 组比较,在、组升高(分别为 、,均 ),预防医学论坛 年月第 卷第期 ,在、组升高(分别为 、,均 ),在 、组均升高(分别为 、,均 )。见表。表各组 细胞 、表达比较(?)组别 组 组 组 组 组 注:与 组比较,。讨论 因对哺乳动物毒性较低而被广泛应用于农业和 家 庭 宠 物 的 昆 虫 防 治。但 近 年 研 究 表 明,不仅选择性作用于昆虫 ,还可与哺乳动物 结合,而哺乳动物 在神经系统和生殖系统(如睾丸间质细胞、支持细胞、精原细胞、胎盘等)中均有表达。因此,暴露可能导致人类及哺乳动物的生殖功能损害。目前,暴露致生殖毒性主要利用动物模型进行研究,但相关机制并不明确。因此,本研究在体外利用 细胞,探究 对生殖细胞的毒性作用及其可能机制。我们在前期研究中探索了 处理 细胞 时的 ,为 ,此剂量较高,可能是由于母体化合物 对 毒性较低,而其代谢产物去甲基啶虫脒发挥主要毒性作用,这有待进一步研究。根据前期的研究结果,本研究 暴露剂量选择为、。细胞活力检测结果发现,细胞活力随 浓度升高而降低,表明 暴露可导致 细胞损伤。但对细胞凋亡相关基因检测发现,、作用后,细胞 显著上调,、作用后 细胞 上调,表明低剂量 暴露可促进 细胞凋亡,而高剂量 暴露则抑制 细胞凋亡。、和 蛋白共同参与调控细胞凋亡,和 比值决定了细胞凋亡的走向,两者可作为 的上游调控因子,过表 达 可 抑 制 的 转 位 和 二 聚 体 化,进 而 抑 制 的激活,发挥抗凋亡作用。因此,低剂量 暴露激活 ,导致了 级联反应,促进凋亡;而高剂量 暴露可能导致了 细胞中抗凋亡通路的激活,使 表达上调,从而发挥了与低剂量不同的抗凋亡作用。这也说明了 具有非单调剂量效应。据此推测,降低细胞活力可能不是通过促进细胞凋亡引起的,其可能是通过影响细胞周期导致细胞活力降低,相关机制仍在研究中。关于 暴露致生殖细胞凋亡的动物实验研究也有报道。等 以 、()染毒雄性大鼠,发现睾丸中精子浓度和血浆睾酮水平呈剂量依赖性下降,、剂量组睾丸 组 织 细 胞 凋亡 率显 著增 加。而 关 于 另 一 种 噻虫胺 的 研 究 发 现,小 鼠 孕 期 和 哺 乳 期()噻虫胺暴露、()可导致雄性子代精子数量降低,但不影响睾丸组织细胞凋亡数量和增殖活性。本研究与体内研究结果的不一致可能是由于 在体内可代谢为去甲基啶虫脒,该代谢产物可能在 致生殖毒性中发挥重要作用,并且其在体内中表现出比 更高的检出率和检测水平。但目前,及其代谢产物对睾丸组织细胞凋亡影响的相关研究较少,还需更多研究明确。信号通路在细胞凋亡调控中发挥重要作用。激活,可使 磷酸化,磷酸化的 与抗凋亡结合蛋白 结合,促进 表达,发挥抗细胞凋亡作用;也可以使 失活,抑制细胞凋亡,。在各组织器官(包括心、肝、肾、睾丸、卵巢、胎盘等)广泛表达。激活,可磷酸化细胞质内的 ,使其不能进入细胞核内诱导凋亡相关因子的转录,从而发挥抗凋亡作用,。本研究发现,处理可导致 、表达上调,表明 可激活 信号通路。这也进一步说明高剂量 可能通过激活 信号通路,抑制 细胞凋亡,而低剂量 暴露时,激活 ,促凋亡作用更为显著。但目前尚未见 对哺乳动物睾丸组织 信号通路影响的体内外研究报道,因此还需深入研究以明确 对该通路的影响。综上所述,可导致 细胞活力降低,剂量越高作用越强;低剂量 可促进 细胞凋亡、高剂量 可抑制细胞凋亡;高剂量 可能通过调控 信号通路发挥抗凋亡作用。本研究还需进一步对相关基因的蛋白表达水平进行检测,以明确 对 信号通路和细胞凋亡的影响。参考文献,预防医学论坛 年月第 卷第期 ,:,():,:,:,():,:,():,():,():,:,()()(),():,():,():,:,:,():潘蓉蓉,金永喜,朱文宗 信号通路介导的细胞凋亡机制研究进展 ,():,():,:作者贡献声明:刘芙:细胞实验,指标检测,撰写论文;王鑫,袁宁:指标监测,原始结果收集、整理与分析;马跃:数据统计分析;马明月:指导研究方案设计及可行性分析,审核论文;毛亚萍:提出研究思路和研究方案,审核并修订论文。收稿日期:本文编辑:韩磊读者作者编者 预防医学论坛 启用“作者贡献声明”为明确论文作者对学术研究及论文的具体贡献与责任,防范不当署名、署名纠纷等学术不端问题,并引导作者负责任署名行为,本刊加强对作者署名的规范要求,自 年始启用作者贡献声明。作者向本刊投稿时需在论文文末列出每位作者的实质性学术贡献,本刊自 年第 卷第期始将对发表的论文于其文末公布作者贡献声明。作者对学术研究及论文的实质性学术贡献,总体而言需包括但不限于以下工作:为研究工作的概念、思路、选题、设计、实施及数据的获取、分析或解释做出重要贡献;撰写论文或对其关键内容进行修改;对最终发表的论文进行全面审核与把关,并作最终定稿;同意对研究工作各个方面负责,保证对论文任何部分的准确性或科研诚信问题进行调查和解决。除具备以上实质性学术贡献外,作者署名还需同时满足以下条件:了解全部研究过程;了解论文全文内容,认可付诸发表的论文最终版本的内容,包括本人和其他全部作者贡献的表述;同意署名,认可署名角色和顺序;同意承担署名责任。预防医学论坛 编辑部 年月预防医学论坛 年月第 卷第期 ,