2023年hrtgf（教学课件）.ppt

基于基于MALDI-TOF质谱技术的病原体快速检测质谱技术的病原体快速检测 顾鑫 2022.1.13 病原体临床检测需要有高通量，高精确度，快速的技术方法。基于质谱测定的病原体检测技术既纳入了PCR技术的优势，可以对微量或无法体外培养的病原体进行扩增，同时也融入了MALDITOF质谱检测的RNA片段的快速、精确、高通量的特性。我们确定了一些常见细菌的管家基因如16s RNA，DNA Gyrase，Hsp70等的特定片段，尽管它们高度保守，但仍在序列上存在一定的差异。经过PCR扩增，体外转录以及核酸内切酶RNase T1作用，这些差异将产生不同的RNA片段质谱图谱，以作为细菌鉴别的标准。实验材料 菌株菌株 E.coli(atcc25922)Salmonella typhimurium(atcc14028)均为标准菌株 试剂试剂 PCR，体外转录试剂:购于Fermentas Maldi Tof 基质:2,4,6-trihdroxyacetophenone(THAP)；3-hydroxypicolinic acid(3-HPA)；6-aza-2-thiothymine(ATT)购于sigma 实验方法 通过BLAST我们确定了16S rRNA，Hsp70，RNA Pol B等候选管家基因，通过Clustal将不同细菌的管家基因序列比对，我们寻找长度在300-600bp,保守性较低的区域作为目标片段。再目标片段上下游设计通用引物，其中正向/负向引物5端分别附加有T7Gtaatacgactcactataggg/Sp6(Atttaggtgacactatagaa)启动子序列。鉴定方法主要依赖于不同细菌RNA酶解片段的质核比的比对,考虑到尿嘧啶UTP的质量306.2Da与胞嘧啶CTP质量305.2Da相差只有1Da，两种核苷酸的质量差异太小将会降低该方法的可靠性。在体外转录体系中我们选择用amino-allyl uridine(aaU)完全替代普通UTP，使得U与C之间的质量差增至55Da，大大提高了该方法的分辨率。结果与讨论 PCR扩增扩增 泳道顺序为：1:E.Coli-16sRNA-1;2:E.Coli-16s-RNA-2;3:E.Coli-16sRNA-3;4:E.Coli-DNA Gyrase-1;5:E.Coli-DNA Gyrase-2;6:DMA ladder;7:Salmonella-16sRNA-1;8:Salmonella-16sRNA-2;9:Salmonella-16sRNA-3;10:Salmonella-DNA Gyrase-1;11:Salmonella-DNA Gyrase-2 由图可以看出PCR引物设计合理，可以得到预计大小的特异性条带。用标准样品探求不同基质的效果用标准样品探求不同基质的效果 我们取用三种DNA标样:STD-1 GTTATATT(2414.6Da);STD-2:AGTGATTTTGT3377.3Da;STD-3:AGTGATTTTGTGTTATATT5850.98Da来进行研究 由图可见，ATT和THAP为基质时,标样的峰图比较杂，且不见约5800Da的大片段。而以3-HPA为基质的组中,标样的峰比较清晰，强度比较大，并且清晰可见三个标样的峰，与理论质量相符合。考虑到长的核酸片段将能更好的作为区分不同的细菌，我们希望尽可能多的检测到清晰的大片段的质荷比信息，因而我们初步选定用3-HPA作为基质进行细菌样品研究。ziptip和oligo beads的脱盐效果，对于STD样品来讲，并没有很显著的差异。这可能是由于STD样品本身溶于ddH2O，并没有很多盐离子的在溶液中，所以无法比较两种脱盐方法的优劣。为了比较ziptip和oligo beads 两种脱盐方法，选用了RNA酶解样品来进行实验 由图可见，对于同样的RNA酶解样品，由于溶液中含有PCR buffer，转录buffer，酶，dNTP，NTP等成分，可以比较得出ziptip脱盐效果比oligo beads 脱盐效果好很多。ziptip脱盐得到的质谱峰图中每个峰清晰，峰强度高，并且检测到的峰的数量也大大多余oligo beads组。由此我们最终决定选用3-HPA作为核酸检测的基质，并采用ziptip脱盐方法。E.Coli 与 Salmonella图谱比对 我们选择了E.coli/Salmonella-16sRNA,DNA Gyrase 以及Hsp70管家基因片段，做体外转录，RNase T1酶解，ziptip脱盐，得到Maldi Tof图谱。可以看出，图谱的整体趋势是比较类似的，特别是对于一些强度较高的峰以及质核比较小的峰，在两张图谱中均可找到。可能的解释是因为首先管家基因在不同细菌种类间本身保守，并且16sRNA基因又是其中高度保守的一种，这点在我们进行引物设计的时候已经发现。另外，较小的峰代表较短的片段，在基因组中本身重复出现的几率就大一些。但是我们仍然可以在两张图谱中找到一些独特的峰，这些峰将可能可以作为区分这两种细菌的标准之一。a1.E.coli 16sRNA a2.E.coli 16sRNA a3.E.coli 16sRNA b1.S.typhimurium 16sRNA b2.S.typhimurium 16sRNA b3.S.typhimurium 16sRNA c1.E.coli DNA gyrase c2.E.coli DNA gyrase c3.E.coli DNA gyrase d1.S.typhimurium DNA gyrase d2.S.typhimurium DNA gyrase d3.S.typhimurium DNA gyrase e1.E.coli hsp70 e2.E.coli hsp70 e3.E.coli hsp70 f1.S.typhimurium Hsp70 f2.S.typhimurium Hsp70 f3.S.typhimurium Hsp70 我们知道正离子模式下postive mode，每个片段离子化时会带有一个质子的正电荷飞行，根据四种核苷酸残基的质量，因而 Mass-Theory=Ax329.2+Gx345.2+Cx305.2+Ux310.2+18.0148+1.0072Da 由于目测质谱图谱的局限性，我们尝试设计一种计算方法用于比对质谱数据和理论酶切得到的质量。Matching-Score=(CI x 2+DI x5+UI x1)/(CI+NI+UI)Common ions(CI),ions shared by E.coli and Salmonella Discriminative ions(DI),or ions that can discriminate E.coli genes from S.typhimurium Unmatched ions(UI),or ions that dont fit into the above CI and DI 以大肠杆菌以及沙门氏杆菌为例，选取了16sRNA，Hsp70，DNA Gyrase特定片段，初步建立了运用质谱分析RNA片段以鉴定常见细菌的方法：1.通过序列比对确定了16S rRNA，Hsp70，DNA Gyrase等候选管家基因，并找到了适宜质谱分析的基因片段。设计通用引物，其中正向/负向引物5分别附加有T7/Sp6启动子序列。2.在进行体外转录时我们用amino-allo-UTP(aaU)替代UTP，增加了U与C间的质量差异，提高了方法的精确度。通过3次独立实验，得到可重复的候选基因片段RNA片段质谱图谱，证实了该方法的可靠性。3.比较了3-HPA，THAP，ATT三种用于核苷酸的Maldi基质以及ziptip与oligo beads 的脱盐效果，最终优化了针对核苷酸样品的基质-3-HPA，以及脱盐方法-ziptip。4.通过将质谱数据与序列的理论酶切片段质量进行比对,将图谱数据与理论质荷比公差定为为1Da，并将峰强度考虑进去，设计初步的算分方法，得到的结果根本符合我们的预期，但仍有待进一步验证和完善。