卡格列净通过PDGF_SIRT1减轻糖尿病肾病小鼠肾纤维化.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(3):275-279 J Med Mol Biol,2024,21(3):275-279DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.03.014资助项目:海南省卫生健康行业科研项目(No.20A200012)通讯作者:李大伟(电话:18689839588,E-mail:L)This work was supported by a grant from the Hainan Provincial Health Industry Scientific Research Project(No.20A200012)Corresponding author:LI Dawei(Tel:86-18689839588,E-mail:L)卡格列净通过 PDGF/SIRT1 减轻糖尿病肾病小鼠肾纤维化曾维新,云川,李晓燕,李大伟海南医学院第一附属医院内分泌科 海口市,570102【摘要】目的 探讨卡格列净通过 PDGF/SIRT1 减轻糖尿病肾病小鼠肾纤维化的潜在机制。方法使用链脲菌素(streptozotocin,STZ)建立糖尿病肾病小鼠模型,并设置以下组别:对照小鼠;STZ 灌胃小鼠;卡格列净处理的 STZ 小鼠;BSA 处理的 STZ 小鼠;PDGF 蛋白处理的 STZ 小鼠;卡格列净与 BSA 共处理的 STZ 小鼠;卡格列净与 PDGF 蛋白共处理的 STZ 小鼠。采集各组小鼠肾脏组织和血清,分析肌成纤维细胞标志物(型胶原、纤维连接蛋白、-SMA)的 mRNA 水平和蛋白水平、线粒体生物发生的指标(线粒体 DNA 拷贝数、关键调节因子 SIRT1 和电子传递链蛋白的不同亚基的表达水平)、血清中PDGF 的表达水平。结果 STZ 显著增强了型胶原、纤维连接蛋白和-SMA 的 mRNA 和蛋白表达;而卡格列净治疗后,这些肌成纤维细胞标志物的表达水平恢复到了正常水平。STZ 降低了线粒体 DNA 拷贝数,而卡格列净可以阻止这种下降。同时,卡格列净纠正了 STZ 导致的 SIRT1、抑制素1(PHB1)、热休克蛋白60(HSP60)、电压依赖性阴离子通道(VDHC)、琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基 A(SDHA)和细胞色素 C 氧化酶(Cox)的降低。此外,STZ 诱导的 PDGF 的上升因卡格列净的存在而恢复。相比于 STZ处理小鼠,STZ 与 PDGF 蛋白共处理的小鼠肾脏中 SIRT1 的表达水平更低、肌成纤维细胞标志物的 mRNA水平更高;相比于 STZ 与卡格列净共处理小鼠,STZ、PDGF 蛋白与卡格列净共处理的小鼠肾脏中 SIRT1 的表达水平、肌成纤维细胞标志物的 mRNA 水平无显著区别。结论 卡格列净治疗可以减轻糖尿病肾病的肾纤维化病变,并且依赖于 PDGF/SIRT1 介导的线粒体生物发生轴。【关键词】卡格列净;PDGF;SIRT1;糖尿病肾病;肾纤维化【中图分类号】R969.4Canagliflozin Alleviates Renal Fibrosis in Diabetic Nephropathy Miceby PDGF/SIRT1ZENG Weixin,YUN Chuan,LI Xiaoyan,LI DaweiDepartment of Endocrinology,First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou,570102,China【Abstract】Objective To investigate the potential mechanism of canagliflozin alleviating renalfibrosis in diabetic nephropathy mice through PDGF/SIRT1.MethodsThe diabetic nephropathymouse model was established using streptozotocin(STZ),and the following groups were set up:control mice,STZ mice,STZ mice treated with canagliflozin,BSA treated STZ mice,STZ treated with PDGF antibody,STZ mice co-treated with canagliflozin and BSA,STZmice co-treated with canagliflozin and PDGF antibody.The kidney tissues and serum of mice in eachgroup were collected.The mRNA and protein expression levels of myofibroblast markers(type I col-lagen,fibronectin,-SMA)were detected.The mitochondrial biogenesis indicators(the mito-chondrial DNA copy number and the expression levels of key regulatory factors SIRT1 and differentsubunits of electron transport chain proteins)were analyzed.And the levels of serum PDGF weremeasured.Results STZ significantly enhanced the mRNA and protein expression levels of type Icollagen,fibronectin and-SMA.However,the expression levels of these myofibroblast markerswere returned to normal levels after canagliflozin treatment.STZ reduced mitochondrial DNA copynumber,and canagliflozin prevented this decline.At the same time,STZ-induced reductions inSIRT1,PHB1,HSP60,VDHC,SDHA,and Cox IV were blocked by canagliflozin.Furthermore,the STZ-induced rise in PDGF level was restored by the presence of canagliflozin.The expressionlevel of SIRT1 in the kidneys of STZ and PDGF co-treated mice was lower and the mRNA expressionlevels of myofibroblast markers were higher,when compared with those in the kidneys of of STZ-treated mice.And there were no significant differences in the expression levels of SIRT1 and mRNAexpression levels of myofibroblast markers in the kidneys of mice co-treated with STZ,PDGF andcanagliflozin,when compared with those of the STZ mice co-treated with canagliflozin andBSA.Conclusion Canagliflozin therapy can reduce renal fibrosis in diabetic nephropathy mice andthe mechanism is dependent on the PDGF/SIRT1-mediated mitochondrial biogenesis axis.【Key words】canagliflozin;PDGF;SIRT1;diabetic nephropathy;renal fibrosis 糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症,是导致终末期肾病的主要原因,占所有肾功能障碍原因的近一半1。糖尿病肾病的特征是肾小球系膜细胞增殖、系膜基质积累、肾脏纤维化和晚期肾小球硬化2。研究表明3,如果不进行干预,20%40%的2 型糖尿病患者会发生肾脏纤维化。在一组大型临床试验中,在糖尿病肾病患者的中位随访 2.6 年时,卡格列净组肾脏疾病和心血管事件的风险低于安慰剂组(ClinicalTrials.gov 编号:NCT02065791)4。然而,卡格列净缓解肾脏纤维化的具体分子机制尚不清晰。线粒体功能障碍是糖尿病肾病发病的一个致病因素,并且血小板源性生长因子(platelet-derived growth fac-tor,PDGF)/沉寂信息调节因子(sirtuin 1,SIRT1)轴是线粒体生物发生的关键调节通路5-6。因此,卡格列净是否通过 PDGF/SIRT1 轴来缓解糖尿病肾病的肾纤维化值得研究。基于此,本研究旨在探讨卡格列净通过 PDGF/SIRT1 减轻糖尿病肾病小鼠肾纤维化的潜在机制。1 材料与方法1.1 材料链脲菌素(streptozotocin,STZ)购自上海玻尔化学试剂有限公司(货号:18883-66-4)。卡格列净(canagliflozin)购自上海源叶生物科技有限公司(货号:S82057-25g)。牛血清白蛋白(bo-vine serum albumin,BSA)、胶原蛋白(Collagen)抗体、纤连蛋白(Fibronectin)抗体、-平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin,-SMA)抗体、SIRT1 抗体、抑制素 1(prohibitin 1,PHB1)抗体、热 休 克 蛋 白 60(heat shock protein 60,HSP60)抗体、电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)抗体、琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基 A(succinate dehydrogenasecomplex flavoprotein subunit A,SDHA)抗体、PDGF蛋 白 购 自 美 国 ABCAM 公 司(货 号:ab64009、ab138492、ab2413、ab5831、ab110304、ab75766、ab190828、ab306581、ab14715、ab202554、ab307483)。Trizol 试剂购自深圳赛尔玛生物技术有限公司(货号:GK20008-100 mL)。cDNA 合成试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司(货号:G3334-25)。SYBR GreenSupermix 购自杭州沃森生物技术有限公司(货号:M2211)。PDGF ELISA 试剂盒购自武汉菲越生物科技有限公司(货号:FY-EM14566)。DNA 分离试剂盒购自 上 海 朝 瑞 生 物 科 技 有 限 公 司(货 号:GMS20079.2.1)。1.2 小鼠造模与处理所有实验动物均符合美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南,并经我院动物伦理与使用委员会批准。将 8 周龄雄性 C57BL/6 J 小鼠置于温度21 23、湿度45%55%的控制条件下,光照/黑暗交替 12 h。使用 STZ 建立糖尿病肾病小鼠模型。高脂饮食喂养 8 周后,小鼠被随机分配到以下组别:对照组(Control,n=5);STZ 灌胃的小鼠(STZ,n=5);卡格列净处理的 STZ 小鼠(STZ+Canagliflozin;n=5);BSA 处理的STZ 小鼠(STZ+BSA,n=5);PDGF 蛋白处理的 STZ 小鼠(STZ+Anti-PDGF,n=5);卡格列净与 BSA 共处理的 STZ 小鼠(STZ+Canagliflozin+BSA,n=5);卡格列净与 PDGF 蛋白共处理的STZ 小 鼠(STZ+Canagliflozin+Anti-PDGF,n=5)。对 7 组小鼠分别进行标记和称重。对于STZ 小鼠,小鼠连续 3 天腹腔注射 STZ(40 mg/kg柠檬酸缓冲液,pH=4.0)或溶剂。只有连续 2 个早晨非空腹血糖水平 16.7 mmol/L 的动物才被纳入研究。从 STZ 给药时开始,在饮用水中添加卡格列净(0.6 mg/mL)。将 BSA 或 PDGF 蛋白(1mg/kg)以尾静脉注射形式给予小鼠。根据日平均耗水量计算,当卡格列净在水中的浓度为 0.6 mg/mL 时,卡格列净的用量为 100 mg/(kgd)。治疗 10 周后处死所有小鼠。同时采集肾脏组织和血672曾维新,等.卡格列净通过 PDGF/SIRT1 减轻糖尿病肾病小鼠肾纤维化清作进一步分析。1.3 RNA 抽取与实时荧光定量 PCR用 Trizol 试剂从动物组织中提取总 RNA,用cDNA 合成试剂盒转录成 cDNA。采用 iQ5 multi-color Real-Time PCR 检测系统和 SYBR Green Super-mix 进行基因表达分析。将 mRNA 水平以 GAPDH水平进行归一化。引物序列分别为:-SMA,5-GAGGCACCACTGAACCCTAA-3(正 向)和 5-CATCTCCAGAGTCCAGCACA-3(反向);胶原,5-GTAACTTCGTGCCTAGCAACA-3(正向)和 5-CCTTTGTCAGAATACTGAGCAGC-3(反向);纤维连接 蛋 白,5-CGAGGTGACAGAGACCACAA-3(正向)和5-CTGGAGTCAAGCCAGACACA-3(反向)。1.4 组织蛋白提取与免疫印迹组织用台式匀浆机在冷冻组织裂解缓冲液(25 mmol/L TrisHCl,pH 7.4;100 mmol/L NaF,50 mmol/L Na4P2O7,10 mmol/L Na3VO4,10 mmol/L EGTA;10 mmol/L EDTA;NP-40 1%;10 g/mL lepeptin,抑肽酶 10 g/ml,2 mmol/L PMSF 和20 nmol/L 冈田酸)。均质后,裂解物在 4 下旋转 30 min,然后在 4 下 12 000 r/min 离心 20min。去除脂质层,将上清液转移到埃彭多夫管中离心。这个过程重复两次以完全去除脂质。采用Bio-Rad 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。在每个样品中制备等效的蛋白质浓度,并在 Laemmli 缓冲液中于 100 煮沸 5 min。将裂解物冷却至室温后进行免疫印迹分析。组织裂解物的样品通过 SDS-PAGE 分离,然后转移到聚偏氟乙烯膜上。用10%牛奶封闭剂在室温下孵育 1 h 后,用相应抗体(Collagen 抗体、Fibronectin 抗体、-SMA 抗体、SIRT1 抗体、PHB1 抗体、HSP60 抗体、VDHC 抗体、SDHA 抗体、Cox IV 抗体),用一抗在 4 下孵育过夜。孵育后,在 TBST 中冲洗膜 3 次,与二抗室温孵育 1 h。在 TBST 中洗涤 3 次后,使用化学发光测定系统显像膜。通过 Image J 程序定量相对蛋白水平。1.5酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)检测血清中 PDGF 水平 使用 PDGF ELISA 检测试剂盒检测各组小鼠血清中 PDGF 的水平。1.6 线粒体 DNA 拷贝数分析线粒体生物发生通过多重 qPCR 评估每个细胞的线粒体 DNA拷贝数。DNA 分离试剂盒提取小鼠组织中的总DNA。总 DNA 的浓度和纯度由 Nanodrop 1000 分光光度计在 260 nm 和 280 nm 处的吸光度读数控制;所得 DNA 的完整性通过凝胶电泳进行评估。10ng/L 的总 DNA 与 2 对引物混合。为了确定线粒体 DNA 产物的相对数量,使用了线粒体基因组中特异性基因 NADH 脱氢酶 1(NADH dehydrogenase1,Nd1)和 肽 基 脯 氨 酰 异 构 酶 A(PPIases,PPIA)。DNA 标准曲线用于估计每次 qPCR 运行的 PCR效率,并将汇总的 DNA 样本用作运行间校准器。根据 Nicklas 等7发布的公式计算线粒体 DNA 拷贝数以分析线粒体生物发生。1.7 统计学处理所有分析均采用 SPSS 18.0。两组间比较采用 t检验进行统计学比较。2 结果2.1 卡格列净对糖尿病肾病肾纤维化的影响STZ 显著增强了型胶原(Collagen)、纤维连接蛋白(Fibronectin)和-SMA 的表达;而卡格列净治疗后,这些肌成纤维细胞标志物的表达水平恢复到了正常水平(图 1A 图 1C)。同样,STZ 诱导的胶原、纤维连接蛋白和-SMA 的增加被卡格列净的治疗效果显著抵消(图1D、1E)。A:型胶原的 mRNA 表达水平;B:纤维连接蛋白的 mRNA 表达水平;C:-SMA 的 mRNA 表达水平;D:型胶原、纤维连接蛋白和-SMA 的蛋白表达水平;E:型胶原、纤维连接蛋白和-SMA 的蛋白表达水平统计。1:Control 组;2:STZ 组;3:STZ+Canagliflozin 组。与 Control 组比较,P0.05。图 1 卡格列净对糖尿病肾病肾纤维化的影响772医学分子生物学杂志,2024,21(3):275-279 J Med Mol Biol,2024,21(3):275-2792.2 卡格列净对 PDGF/SIRT1/PGC-1 介导的线粒体生物发生的影响 STZ 降低了线粒体 DNA 拷贝数,而卡格列净可以阻止这种下降(图 2A)。STZ 诱导的 SIRT1、PHB1、HSP60、VDHC、SDHA 和 Cox IV 的降低被卡格列净增强(图 2B、图 2C)。STZ 诱导的 PDGF的上升因卡格列净的存在而恢复(图 2D)。相比于 STZ 处理小鼠,STZ 与 PDGF 蛋白共处理的小鼠肾脏中 SIRT1 的表达水平更低、肌成纤维细胞标志物的 mRNA 水平更高;相比于 STZ 与卡格列净共处理小鼠,STZ、PDGF 蛋白与卡格列净共处理蛋白共处理的小鼠肾脏中 SIRT1 的表达水平、肌成纤维细胞标志物的 mRNA 水平无显著区别(图 2E 2 G)。A:Nd1/PPIA 比值;B:SIRT1、PHB1、HSP60、VDHC、SDHA 和 Cox IV 的蛋白表达水平;C:SIRT1、PHB1、HSP60、VDHC、SDHA 和 Cox IV 的蛋白表达水平统计;D:PDGF 蛋白水平;E:SIRT1 的蛋白表达水平;F:SIRT1 的蛋白表达水平统计;G:型胶原、纤维连接蛋白和-SMA 的 mRNA 表达水平。1:Control 组;2:STZ 组;3:STZ+Canaglifloz-in 组;4:STZ+BSA 组;5:STZ+Canagliflozin+BSA 组;6:STZ+PDGF 组;7:STZ+Canagliflozin+PDGF 组。与 Con-trol 组比较,P0.05。图 2 卡格列净对 PDGF/SIRT1/PGC-1 介导的线粒体生物发生的影响2 讨论STZ 是一种自然产生的化学物质,对哺乳动物胰腺中产生胰岛素的 细胞尤其有毒8。广泛用于大剂量的高血糖动物模型,以及多次低剂量的 2型糖尿病或 1 型糖尿病动物模型9。经 STZ 治疗的高脂性肥胖小鼠作为糖尿病肾病模型10,在本研究中采用了该模型。糖尿病肾病会不可避免地引起肾纤维化病变,增强肌成纤维细胞标志物的表达。为了研究卡格列净是否能预防肾纤维化,本研究首先分析了肌成纤维细胞标志物的 mRNA 水平。STZ 显著增强了型胶原、纤维连接蛋白和-SMA的表达;而卡格列净治疗后,这些肌成纤维细胞标志物的表达水平恢复到了正常水平。为了加强上述观察到的变化,本研究用免疫印迹分析了这些基因在蛋白水平上的表达。同样,STZ 诱导的胶原 I、纤维连接蛋白和-SMA 的增加被卡格列净的治疗显著抵消。这些数据表明,卡格列净治疗可以减轻糖尿病肾病的肾纤维化病变。线粒体功能障碍是糖尿病肾病发病的一个致病因素11。越来越多的证据表明,线粒体能量学与糖尿病肾病进展密切相关12。这个结论很容易被接受,因为肾脏是人体中最需要能量的器官之一13。在人体各种器官中,肾脏的线粒体含量和耗氧量仅次于心脏14。线粒体功能障碍导致 ATP生成减少、细胞功能和结构改变以及肾功能损害15。改善线粒体功能的药物干预被认为是治疗肾脏疾病的有效策略16。为了揭示卡格列净对糖尿病肾病保护作用的潜在分子机制,本研究通过线粒体 DNA 拷贝数分析线粒体生物发生,发现 STZ降低了线粒体 DNA 拷贝数,而卡格列净可以阻止这种下降。为了研究线粒体的功能,本研究分析了872曾维新,等.卡格列净通过 PDGF/SIRT1 减轻糖尿病肾病小鼠肾纤维化线粒体生物发生的关键调节因子 SIRT1 和电子传递链蛋 白 的 不 同 亚 基。结 果 显 示,STZ 诱 导 的SIRT1、PHB1、HSP60、VDHC、SDHA 和 Cox的降低被卡格列净增强。研究表明5-6,PDGF/SIRT1轴是线粒体生物发生的关键调节通路,因此,本研究通过酶联免疫分析了 PDGF 的蛋白水平。结果表明,STZ 诱导的 PDGF 的上升因卡格列净的存在而恢复。相比于 STZ 处理小鼠,STZ 与 PDGF 蛋白共处理的小鼠肾脏中 SIRT1 的表达水平更低、肌成纤维细胞标志物的 mRNA 水平更高。提示 PDGF 的上升促进了糖尿病肾病的肾纤维化。相比于 STZ 与卡格列净共处理小鼠,STZ、PDGF 蛋白与卡格列净共处理蛋白共处理的小鼠肾脏中 SIRT1 的表达水平、肌成纤维细胞标志物的 mRNA 水平无显著区别。这些数据表明,卡格列净保护糖尿病肾病的肾功能障碍,这可能依赖于 PDGF/SIRT1 介导的线粒体生物发生轴。综上所述,卡格列净治疗可以减轻糖尿病肾病的肾纤维化病变,并且依赖于 PDGF/SIRT1 介导的线粒体生物发生轴。参考文献1 PELLE M C,PROVENZANO M,BUSUTTI M,et al.Up-date on diabetic nephropathy J.Life,2022,12(8):1202.2 SAWAF H,THOMAS G,TALIERCIO J J,et al.Therapeu-tic advances in diabetic nephropathy J.J Clin Med,2022,11(2):378.3 HUANG T,WU T,WU Y,et al.Long-term statins admin-istration exacerbates diabetic nephropathy via ectopic fatdeposition in diabetic miceJ.Nat Commun,2023,14(1):390.4 PERKOVIC V,JARDINE M J,NEAL B,et al.Canaglifloz-in and renal outcomes in type 2 diabetes and 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