辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜的影响.pdf

第 41 卷 第 6 期2023 年 11 月食 品 科 学 技 术 学 报Journal of Food Science and TechnologyVol.41 No.6Nov.2023doi:10.12301/spxb202300136文章编号:2095鄄6002(2023)06鄄0103鄄12引用格式:黄志远,董文明,田洋,等.辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜的影响J.食品科学技术学报,2023,41(6):103-114.HUANG Zhiyuan,DONG Wenming,TIAN Yang,et al.Effect of Moringa oleifera seed antimicrobial peptide on Staphylo鄄coccus aureus biofilmJ.Journal of Food Science and Technology,2023,41(6):103-114.辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜的影响黄志远,摇 董文明,摇 田摇 洋,摇 黄艾祥,摇 王雪峰*(云南农业大学 食品科学技术学院,云南 昆明摇 650201)摘摇 要:辣木籽抗菌肽 MOp2、MOp3 对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果,但是其对生物膜是否产生影响尚未清楚。采用结晶紫半定量法、荧光显微镜观察、酶解实验和分子对接技术等探讨从辣木籽蛋白水解物中分离鉴定到的新型抗菌肽 MOp2、MOp3 对金黄色葡萄球菌生物膜的影响。结果表明:MOp2、MOp3 的最小抑制生物膜质量浓度(MBIC)和最小清除生物膜质量浓度均为 4 mg/mL和 8 mg/mL;1 伊 MBIC 下 MOp2 与 MOp3 对金黄色葡萄球菌生物膜清除率分别为 63郾 28%和67郾 90%;荧光显微镜发现,MOp2、MOp3 处理后的生物膜黏附减少,细菌数量减少;细菌初期黏附率在1 伊 MBIC的 MOp2、MOp3 处理后分别降低44郾 19%和50郾 77%,且表面疏水性降低;酶解实验表明,金黄色葡萄球菌生物膜胞外聚合物中含量最多的为胞外蛋白(质量分数 49郾 01%),其次为胞外多糖和胞外 DNA,且 MOp2、MOp3 会抑制胞外聚合物中这 3 种成分的分泌合成;分子对接结果显示,MOp2、MOp3 均可以与生物膜形成关键蛋白 AgrA、CshA、LuxS 和 SarA 结合,这可能对金黄色葡萄球菌群体感应系统造成一定影响,从而抑制生物膜形成。研究旨在为辣木籽抗菌肽在食品工业中的防腐保鲜应用提供理论依据。关键词:辣木籽抗菌肽;金黄色葡萄球菌;生物膜;胞外聚合物;分子对接中图分类号:TS201郾 6摇 摇 摇 摇 摇 文献标志码:A收稿日期:20230309基金项目:国家自然科学基金地区项目(31960462);云南省农业联合专项(202101BD070001鄄013);云南省科协青年科技人才托举工程项目。Foundation:National Natural Science Foundation of China(31960462);Joint Agricultural Project of Yunnan Province(202101BD070001鄄013);Young Elite Scientists Sponsorship Program by Yunnan Science and Technology Association.第一作者:黄志远,男,硕士研究生,研究方向为抑菌类生物活性肽及其抑菌机制。摇*通信作者:王雪峰,男,副教授,博士,主要从事食品蛋白质资源利用与乳品科学方面的研究。摇 摇 近年来,食品安全已成为全球公共卫生关注的焦点问题。微生物污染是最常见的食品安全问题之一,可引起食品腐败和食源性疾病,从而影响人类的健康,并造成巨大的经济损失1。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是一种革兰氏阳性共生细菌2,作为世界上第三大食源性致病菌,可引起菌血症、败血症等疾病3,在中国超过 25%的食源性疾病都与 S.aureus 有关4。而导致感染的毒力因子受细菌生长阶段的调控,细菌在早期对数期时会产生细胞因子,这些因子使细菌能够逃避宿主的防御并建立生物膜5。生物膜是一种具有良好结构和多样性的动态细菌胞外聚集物,对抗生素的耐药性是原菌株的 10 1 000 倍6。因此,有必要寻找新型抑制剂进一步抵抗细菌生物膜的形成。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一类具有天然生物活性的多肽,对细菌、病毒、真菌都有抑301制作用7。它们是生物体(如两栖动物、哺乳动物、昆虫和植物)用来对抗病原体入侵的天然免疫屏障,被称为“第二防御系统冶8。与传统抗生素不同,AMPs 具有多靶点的抑菌机制,一些 AMPs 可以通过破坏细胞壁膜、作用于 DNA 和 RNA、抑制蛋白质合成以及增加细胞内活性氧的水平来发挥作用,因此不易产生耐药性9。并且 AMPs 对环境友好,具有良好的稳定性,可以在食品工业中作为一种新型食品防腐剂保存原料与产品10。同时,有研究表明,一些 AMPs 可以有效抑制生物膜的形成,甚至对成熟的生物膜造成破坏11。如来自舌兰蛙的抗菌肽 brevin鄄gr23 可显著抑制胞外多糖的产生、金黄色葡萄球菌生物膜的附着和形成12。螺旋肽 G3 可以在不同阶段干扰变形链球菌生物膜的形成,在初始阶段,G3 通过降低细菌表面电荷、疏水性、膜完整性和黏附相关基因转录来抑制细菌黏附;在后期,G3与胞外聚合物中的胞外 DNA(eDNA)相互作用,破坏成熟生物膜的 3D 稳定性结构,从而分散它们13。MOp2 和 MOp3 是本课题组前期从辣木籽蛋白水解物中分离鉴定到的 2 种新型阴离子抗菌肽。MOp2 相对分子质量为 907郾 06,MOp3 相对分子质量为 712郾 81,都带 1 个负电荷,固体状态下结构以茁鄄转角为主,具有良好的稳定性,使用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理 1 h 后仍保留 70%以上的活性。它们对S.aureus 表现出了良好的抑菌活性,并且对 S.au鄄reus 造成一定的膜损伤14-15。但 MOp2、MOp3 是否会对 S.aureus 的生物膜产生抑制作用鲜有研究。因此,本研究拟通过分析 MOp2、MOp3 对 S.aureus生物膜的形成能力以及成熟生物膜的影响,结合分子对接技术解析 2 种辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜的抑制作用。1摇 材料与方法1郾 1摇 材料与试剂S.aureus(CICC 10384),中国工业培养收集中心。结晶紫(分析纯)、DAPI 荧光染料(分析纯),中国碧云天生物技术有限公司;刃天青(分析纯),中国索莱宝科技有限公司。MOp2(肽序列:HVLDT鄄PLL)、MOp3(肽序列:HVLDTPLL),肽段纯度 98%以上,安徽省国平药业有限公司。1郾 2摇 仪器与设备Multiskan Go 型酶标仪,美国 Thermo Scientific公司;Dmi3000B 型荧光显微镜,德国 Carl Zeiss AG公司;DHp-600 型电热恒温培养箱,北京市永光明医疗仪器有限公司;TGL20M 型台式高速离心机,北京中兴伟业仪器有限公司;LDZM-60KCS 型立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂。1郾 3摇 实验方法1郾 3郾 1摇 S.aureus 生物膜形成能力测定参照 Ommen 等16方法并稍加修改。在 24 孔板中分别加入 2 mL 无菌胰蛋白胨大豆培养基(TSB)和 体 积 分 数1%的 细 菌 菌 悬 液(108CFU/mL),在37 益下分别培养 4、8、12、24、48、72、96、120 h。培养完成后,弃去培养基,并用 PBS清洗以除去浮游细菌。然后向各孔添加 500 滋L 甲醇,固定 1 h 后弃去甲醇并用 PBS 洗涤。向各孔加入体积分数 1%结晶紫染色 15 min 后用 PBS 洗涤。干燥后,加入 200 滋L 乙醇-丙酮溶液(体积比 4颐 1),然后在 595 nm 处测定吸光度。1郾 3郾 2摇 辣木籽抗菌肽处理后 S.aureus 最小抑制生物膜质量浓度和最小清除生物膜质量浓度测定参照 Zhang 等17方法并稍加修改。最小抑制生物膜质量浓度(MBIC)测定:在 24 孔板中分别加入 2 mL 无菌 TSB 和体积分数 1%的细菌菌悬液(108CFU/mL),随后加入抗菌肽,使之终质量浓度分别为 0郾 5、1郾 0、2郾 0、3郾 0、4郾 0、6郾 0、8郾 0 mg/mL,37 益培养 48 h 以形成生物膜。然后在每孔中加入噻唑蓝(MTT)溶液 20 滋L(5 mg/mL),2 h 后吸去上清液,用 PBS 清洗以除去游离菌,乙醇脱色后测定OD570 nm。以无菌 TSB 孔为空白对照组,OD 值与空白组相比无显著变化的最小质量浓度定为 MBIC。最小清除生物膜质量浓度(MBEC)测定:生物膜在24 孔板中培养完成后,用 PBS 洗去游离菌,加入与测定 MBIC 相同质量浓度的抗菌肽,然后在 37 益下培养 24 h。MTT 染色后测定 OD570 nm,OD 值与对照组相比无明显变化的最小质量浓度定为 MBEC。1郾 3郾 3摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜的清除作用测定参照 Ommen 等16方法并稍加修改。在 24 孔板中分别加入 2 mL 无菌 TSB 和体积分数 1%的细菌菌悬液(108CFU/mL)。37 益培养 48 h 以形成生物膜,随后弃去 TSB 并使用无菌 PBS 清洗,然后加入 MOp2 与 MOp3(2、4、8 mg/mL),空白对照组中加入无菌水,在 37 益下培养 12 h。在 0、2、4、6、8、10、401食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月12 h 时,参照 1郾 3郾 1 节中结晶紫染色法测定各组样品的 OD595 nm。1郾 3郾 4摇 辣木籽抗菌肽处理后 S.aureus 生物膜微观形态的变化参照 Lin 等18方法并稍加修改。在 6 孔板中分别加入 5 mL 无菌 TSB、体积分数 1%的细菌菌悬液(108CFU/mL)及 1 片无菌盖玻片(2 cm 伊2 cm)。37 益培养48 h 以形成生物膜,随后弃去 TSB 并使用无 菌 PBS 清 洗,然 后 加 入 MOp2与 MOp3(4 mg/mL),空白对照组中加入无菌水。37 益培养12 h 后,取出盖玻片,并加入 DAPI(10 滋g/mL)在黑暗中染色 20 min,随后用荧光显微镜观察生物膜结构。1郾 3郾 5摇 辣木籽抗菌肽处理后 S.aureus 生物膜内细菌新陈代谢的变化将不锈钢片(1 cm 伊 1 cm)在体积分数 75%乙醇中浸泡 24 h,并超声处理 1 h 以除去表面杂质。随后用无菌去离子水彻底清洗,并将不锈钢片121 益高压灭菌 30 min 备用。在 24 孔板中分别加入 2 mL 无菌 TSB、体积分数 1%的细菌菌悬液(108CFU/mL)及 1 片灭菌不锈钢片。37 益下培养48 h 以形成生物膜,随后弃去 TSB 并用无菌 PBS 清洗,然 后 加 入 抗 菌 肽 MOp2 与 MOp3(2、4、8 mg/mL),空白对照组中加入无菌水。处理 4 h,取出不锈钢片置于无菌均质袋,加入 10 mL PBS 超声15 min,使生物膜细菌从不锈钢片上分离并收集菌悬液,在菌悬液中加入体积分数 10%的刃天青溶液,37 益黑暗中振荡 2 h,4 益 下 10 000 r/min 离心10 min 取得上清液,用酶标仪分别检测其在 560 nm激发波长和 590 nm 发射波长处的荧光值。1郾 3郾 6摇 辣木籽抗菌肽处理后 S.aureus 生物膜初期形成的变化1郾 3郾 6郾 1摇 细菌初期黏附实验参照 Bai 等19方法并稍加修改。体积分数 1%的细菌菌悬液(108CFU/mL)接种于含 3 mL 葡萄糖(质量分数 0郾 5%)、氯化钠(质量分数 3%)的脑心浸液培养基中,并加入抗菌肽 MOp2 与 MOp3(2、4、8 mg/mL),空白对照组中加入无菌水,在 37 益下培养至对数期。以 5 000 r/min 冷冻离心 5 min,得细菌沉淀物,将细菌沉淀物置于 37 益下,并加到含纤维蛋白原的 96 孔板中,孵育 1 h 后,用体积分数25%的甲醛固定,然后进行结晶紫染色,用酶标仪测定 OD595 nm。相对黏附率计算见式(1)。相对黏附率=OD(实验)595 nmOD(空白)595 nm伊100%。(1)1郾 3郾 6郾 2摇 辣木籽抗菌肽处理后 S.aureus 表面疏水性的变化体积分数 1%的细菌菌悬液(108CFU/mL)接种于 3 mL 的 TSB 肉汤,并加入抗菌肽 MOp2 与MOp3(2、4、8 mg/mL),空白对照组中加入无菌水,在 37 益下培养 24 h。之后向试管中加入 500 滋L 甲苯,剧烈旋转 3 min,然后静止 10 min,以获得相分离。最后,仔细吸取下层水相,并在涡流前后测定600 nm 处吸光度。疏水率计算见式(2)。疏水率=1-OD(涡流后)600 nmOD(涡流前)600 nm伊100%。(2)1郾 3郾 7摇 辣木籽抗菌肽处理后 S.aureus 生物膜胞外聚合物的变化1郾 3郾 7郾 1摇 酶解实验在 48 孔板中分别加入 2 mL 无菌 TSB 和体积分数 1%的细菌菌悬液(108CFU/mL)。37 益下培养 48 h 以形成生物膜,培养后弃掉培养基。实验共设置 4 组样品,其中 1 组为空白组,其余 3 组为实验组,每组设置 10 个复孔。空白组中加入无菌水,实验组分别加入高碘酸钠(10 滋mol/L)、脱氧核糖核酸酶(2 mg/mL)和蛋白酶 K(100 滋g/mL)。将 48 孔板在 37 益 培养 2 h,并用结晶紫染色。乙醇脱色 30 min 后,用酶标仪测定 595 nm 处的吸光度。1郾 3郾 7郾 2摇 细菌胞外多糖含量测定参照崔海英等20方法并稍加修改。将不锈钢片(1 cm 伊 1 cm)在体积分数 75%的乙醇中浸泡24 h,并超声处理 1 h 以除去表面杂质。随后用无菌去离子水彻底清洗,并将不锈钢片在 121 益下高压灭菌30 min 备用。在24 孔板中分别加入2 mL 无菌TSB、体积分数 1%的细菌菌悬液(108CFU/mL)及 1片灭菌的不锈钢片。37 益下培养 48 h 以形成生物膜,培养开始时加入抗菌肽 MOp2 与 MOp3(2、4、8 mg/mL),空白组加入等量无菌水。培养完成后,弃去 TSB,并用 PBS 冲洗以除去表面游离菌。将清洗后的不锈钢片置于 PBS 中超声处理1 h,收集菌悬液,10 000 r/min 离心 10 min 取上清液作为胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)样本备用。采用苯酚-硫酸法测定上清液中胞外多糖的含量,将 1 mL 上清液和 1 mL 苯酚(50 g/L)溶液混合,501第 41 卷 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 黄志远等:辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜的影响混合均匀后振荡 30 s,之后加入 15 mL 硫酸(体积分数 95%)溶液,在黑暗中反应15 min 后,将溶液涡旋振荡 10 s,置于恒温水浴中反应 20 min。使用紫外分光光度计检测溶液在 490 nm 处的吸光度,以分析胞外多糖的质量浓度。1郾 3郾 7郾 3摇 细菌胞外蛋白含量测定使用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定样品蛋白质含量。取 1郾 3郾 7郾 2 节中制备的 EPS 样本 40 滋L 于试管中,按照蛋白质加样量(表 1)加样,静置10 min,用酶标仪在波长 595 nm 处测定各管的吸光度,按式(3)计算蛋白质含量。籽(样品)=OD(测定)595 nm-OD(空白)595 nmOD(标准)595 nm-OD(空白)595 nm伊 籽(标准)。(3)表 1摇 蛋白质加样量Tab.1摇 Protein sample loading amount滋L组别V(试剂)蒸馏水蛋白质标准液样品考马斯亮蓝显色液空白管0郾 050郾 000郾 003郾 00标准管0郾 000郾 050郾 003郾 00测定管0郾 000郾 000郾 053郾 001郾 3郾 7郾 4摇 细菌 eDNA 含量测定按照 1郾 3郾 7郾 2 节中方法制备 EPS 样本,使用细菌基因组 DNA 快速抽提试剂盒提取 EPS 中 eDNA后,使用酶标仪检测 260 nm 处的吸光度,并根据吸光度计算 eDNA 含量。1郾 3郾 8摇 分子对接分析对接使用的 AgrA、LuxS、CshA、SarA 蛋白质晶体结构从 Uniprot 数据库中下载获得,其中 AgrA 蛋白的 PDB ID 为 6PRA,其余蛋白质为基于 Alphafold预测的结构。MOp2、MOp3 的 3D 结构采用 PyMol2郾 5郾 2 构建,并保存为 PDB 格式。摇 摇 采用 AutoDock Vina 1郾 1郾 2 软件进行分子对接,在对接开始之前,使用 PyMol 2郾 5郾 2 对受体蛋白进行处理,包括去除水分子、盐离子以及小分子。随后设置对接盒子,使之包裹整个蛋白质结构。此外,使用 ADFRsuite 1郾 03 将所有处理好的小分子以及受体蛋白转换为 AutoDock Vina 1郾 1郾 2 对接必需的 PD鄄BQT 格式。对接时,全局搜索的详尽度设为 32,其余参数保持默认设置。打分最高的对接构象被认为是结合构象,最后使用 PyMol 2郾 5郾 2 对接结果进行可视化分析。1郾 4摇 数据处理实验结果使用 SPSS 26郾 0 软件分析,采用单因素方差分析和 Bonferroni 统计学检验来确定 P 4ODc(ODc=0郾 08)为强生物膜形成株21。48 h 时被认为是生物膜的成熟阶段,生物膜复杂的三维结构完全形成,生物膜内细菌群也处于活跃状态22-23。因此,在后续的实验中,生物膜培养时间选择为 48 h。图 1摇 金黄色葡萄球菌的生物膜形成能力Fig.1摇 Biofilm forming ability of S.aureus摇2郾 2摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜的 MBIC和 MBEC 测定结果辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌的 MBIC 和MBEC 见图 2。由图 2 可知,MOp2、MOp3 对 S.aureus的 MBIC 均为 4 mg/mL,MBEC 均为 8 mg/mL。MOp2与 MOp3 的 MBIC 处于成熟生物膜抑制剂桉叶素(8 mg/mL)24与丁香精油(1 mg/mL)17之间,因此,MOp2、MOp3 有望成为一种新型生物膜抑制剂。2郾 3摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜的清除作用MOp2、MOp3 对 S.aureus 生物膜的清除效果采601食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月不同小写字母表示组间数据差异显著(P 0郾 05)。图 2摇 辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌的 MBIC 和 MBECFig.2摇 MBIC and MBEC of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on S.aureus摇用结晶紫半定量法测定,结果见图 3。空白组的吸光度在 12 h 内基本保持不变,实验组的吸光度随着MOp2、MOp3 质量浓度的增加而减少,说明 MOp2 与MOp3 的质量浓度越高对 S.aureus 生物膜的清除效果越好。1 伊 MBIC 的 MOp2 处理 12 h 后,生物膜清除率达到 63郾 28%,2 伊 MBIC 时生物膜清除率达到80郾 56%。1 伊 MBIC 的 MOp3 处理 12 h 后,生物膜清除率达到 67郾 90%,2 伊 MBIC 时生物膜清除率达到81郾 64%,进一步说明 MOp2、MOp3 可以有效清除生物膜且呈现一定的剂量依赖性。2郾 4摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜微观形态的影响为了研究 MOp2、MOp3 对 S.aureus 生物膜形态结构的影响,采用荧光显微镜对菌体结构进行了微观观察,见图 4。由图 4 可知,空白组图 4(a)生物膜结构完整、立体,处理组图 4(b)至图 4(e)荧光强度明显下降,生物膜三维结构解体,大多呈游离状态分散在玻片表面。结果表明:MOp2、MOp3能破坏 S.aureus 的生物膜立体结构,导致细菌死亡,这与 Reis鄄Teixeira 等25的研究结果一致。2郾 5摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜内细菌新陈代谢的影响细菌的新陈代谢能力一定程度上能反映出菌体细胞的活力。刃天青具有荧光强度,能够穿透细胞膜,通过不同细菌氧化还原酶的作用降解为高荧光强度的中间产物试卤灵。刃天青向试卤灵转化是不可逆的,并且这种转化与参与代谢的细菌数量成正比,因此这种方法可以检测细菌的生存能力26。MOp2、MOp3 对金黄色葡萄球菌生物膜新陈代谢的影响见图 5。由图 5 可知,经过 0郾 5 伊 MBIC 的MOp2 与 MOp3 处理后,S.aureus 生物膜的代谢活性明显下降(P 0郾 05),分别下降了 15郾 60%和20郾 62%;而经过 1 伊 MBIC 的 MOp2 与 MOp3 处理后,S.aureus 生 物 膜 的 代 谢 活 性 显 著 下 降 了54郾 11%和 62郾 34%。造成 S.aureus 生物膜代谢活性下降的原因可能是细菌代谢过程中能量传递的电子传递链主要位于细胞膜的内表面,细胞膜在受到抗菌肽的刺激和破坏后,能量代谢功能紊乱,因此代701第 41 卷 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 黄志远等:辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜的影响图 3摇 辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜的清除效果Fig.3摇 Clearance effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on S.aureus biofilm摇图 4摇 金黄色葡萄球菌生物膜经辣木籽抗菌肽处理前后的荧光显微照片Fig.4摇 Fluorescence micrographs of S.aureus biofilm before and after treatment withMoringa oleifera seeds antimicrobial peptides摇谢活性大大下降,同时先前的研究通过冷冻扫描电镜也发现 MOp2、MOp3 可以破坏 S.aureus 的细胞壁膜结构14-15。2郾 6摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜黏附率的影响生物膜初期形成阶段主要依靠细菌细胞之间的黏附作用聚集到一起,此时细菌利用细胞壁锚定蛋白(CWA)附着于不同载体的表面27。本研究测定了MOp2、MOp3 对 S.aureus 初期黏附的影响,见图6。由图6 可知,0郾 5 伊 MBIC 的 MOp2 与 MOp3 可以显著抑制 S.aureus 的初始定值(P 0郾 05),黏附率分别下降了19郾 84%和24郾 04%;1 伊 MBIC 的 MOp2 与 MOp3对 S.aureus 的黏附呈现了更好的抑制作用,黏附率分别下降了 44郾 19%和 50郾 77%;特别是在 2 伊 MBIC时,黏附率分别下降了 74郾 45%和 75郾 96%。结果表明:MOp2、MOp3 对生物膜菌体的初期黏附能力具有抑制作用且呈现剂量依赖性,细菌初期黏附能力下降,生物膜的形成能力也随之下降。2郾 7摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 表面疏水性的影响细胞表面疏水性与细菌黏附、生物膜的形成密切相关,细菌表面疏水性的降低可能会弱化生物膜的形成能力28。MOp2 与 MOp3 对 S.aureus 表面疏水性的影响见图 7。由图 7 可知,与空白组相比,801食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月不同小写字母表示组间数据差异显著(P 0郾 05)。图 5摇 辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜新陈代谢的影响Fig.5摇Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial pep鄄tides on biofilm metabolism of S.aureus摇不同小写字母表示组间数据差异显著(P 0郾 05)。图 6摇 辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜黏附率的影响Fig.6摇Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial pep鄄tides on biofilm adsorption of S.aureus摇在经过 MOp2 与 MOp3 处理后,细菌表面疏水性均有显著下降(P 0郾 05),且与抗菌肽质量浓度呈正相关;在 2 伊 MBIC 时,S.aureus 的表面疏水性分别下降了 71郾 94%和 73郾 77%,这与杨露等28的研究结果一致。2郾 8摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 胞外聚合物的影响2郾 8郾 1摇 S.aureus 生物膜组成分析成熟的生物膜是附着的微生物群落,能够抵抗不同小写字母表示组间数据差异显著(P 0郾 05)。图 7摇 辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜疏水性的影响Fig.7摇Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial pep鄄tides on biofilm hydrophobicity of S.aureus摇摇 摇 摇 摇外来分子(包括许多小分子抗菌剂)并导致持续感染29。生物膜的形成首先是细菌黏附到表面,然后是群体感应(QS)的聚集、菌落发育和 EPS 的分泌。其中,EPS 具有一系列的功能,如作为支架和将生物膜细胞连接在一起30。同时,EPS 还为生物膜提供了结构稳定性,并维持了其代谢活性。使用高碘酸钠、DNase玉和蛋白酶分别水解多糖、DNA 和蛋白质,测定胞外多糖、eDNA 和胞外蛋白的含量,发现S.aureus 生物膜中含量最高的是蛋白质(质量分数49郾 01%),其次是胞外多糖(质量分数 39郾 73%)和eDNA(质量分数 11郾 26%)。2郾 8郾 2摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜胞外多糖的影响多糖是 EPS 中研究最多的成分,基于糖单体,多糖分为同多糖和杂多糖。EPS 的含量在增长平稳期开始时处于峰值,在指数阶段和稳定阶段观察到 QS 活性,QS 系统的转录调控因子影响胞外多糖操纵子的转录调控因子,并控制胞外多糖的产生31。MOp2 与 MOp3 对细菌胞外多糖含量的影响见图 8。在经过 1 伊 MBIC 的 MOp2 与 MOp3处理 后,胞 外 多 糖 的 含 量 出 现 显 著 下 降(P 0郾 05),分别下降了 22郾 66%和 27郾 39%;2 伊 MBIC时,胞外多糖含量下降更为明显。可能的原因是MOp2 与 MOp3 对 S.aureus 的 QS 系统造成影响,使胞外多糖合成受阻。901第 41 卷 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 黄志远等:辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜的影响不同小写字母表示组间数据差异显著(P 0郾 05)。图 8摇 辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜胞外多糖的影响Fig.8摇Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial pep鄄tides on extracellular polysaccharides of S.aureusbiofilm摇2郾 8郾 3摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜胞外蛋白的影响S.aureus 的胞外聚合物中含量最高的为蛋白质,并且有研究对生物膜的 EPS 基质进行蛋白组学分析,发现存在一些毒力因子,它们是感染宿主的主要蛋白质32,因此,探究 MOp2 与 MOp3 对细菌胞外蛋白分泌的影响尤为重要。辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜胞外蛋白的影响见图 9。经过1 伊 MIBC的 MOp2、MOp3 作用后,胞外蛋白的含量分别下降了 48郾 05%和 39郾 55%;经过 2 伊 MIBC 的MOp2、MOp3 作用后,胞外蛋白的含量分别下降了61郾 57%和 54郾 54%。这说明 MOp2 与 MOp3 在很大程度上阻止了胞外蛋白的形成,并且明显抑制了胞外蛋白的合成与分泌,这与 Vazquez鄄Armenta 等33的研究结果一致。2郾 8郾 4摇 辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜胞外 DNA的影响eDNA 是 S.aureus 生物膜的功能成分,起初eDNA 被认为是一种次要成分,主要与基因转移的基因库有关,但是最近有研究重新评估了其对生物膜形成的贡献。eDNA 通过细胞死亡和裂解释放,主要发生在生物膜的内部,保护细菌免受抗菌剂和抗生素的影响34,此外,eDNA 还能促进细胞间的细胞黏 附35。MOp2 与 MOp3 对 eDNA 的 影 响 见图 10。在 0郾 5 伊 MBIC 与 1 伊 MBIC 时,生物膜 eDNA的含量变化不显著,在 2 伊 MBIC 时,eDNA 含量明显不同小写字母表示组间数据差异显著(P 0郾 05)。图 9摇 辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜胞外蛋白的影响Fig.9摇Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial pep鄄tides on extracellular protein of S.aureus biofilm摇下 降(P 0郾 05),分 别 下 降 了 为 14郾 24%和17郾 55%,与 Secchi 等36的研究结果一致,说明MOp2 与 MOp3 通过抑制 eDNA 的合成,破坏细菌的自我防御系统并导致生物膜无法黏附。不同小写字母表示组间数据差异显著(P 0郾 05)。图 10摇 辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜 eDNA 的影响Fig.10摇Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial pep鄄tides on eDNA of S.aureus biofilm摇2郾 9摇 辣木籽抗菌肽与 S.aureus 生物膜形成关键蛋白的分子对接分析QS 系统在生物膜形成过程中起关键作用。QS 系统中的 AgrA 蛋白对菌体生物膜的形成、毒力因 子 分 泌 等 多 种 生 物 活 性 起 调 控 作 用37。CshA 是一种细菌黏附蛋白,覆盖在细菌细胞表面,011食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 11 月细菌可以利用其附着在基质或者其他细菌上形成生物膜38。QS 系统中 AI鄄2 信号分子的合成依赖LuxS 蛋白酶。LuxS 蛋白酶可以影响细菌形成生物膜以及其耐药性39。葡萄球菌辅助调节因子(SarA)是重要的毒力基因调控因子,可调控约 120个基因的表达,涉及 QS 系统、生物膜合成、耐药性等众多与 S.aureus 致病相关的生理过程40。这 4种蛋白质在生物膜形成过程中发挥重要作用,使用分子对接技术可推测 MOp2、MOp3 是否与这 4种蛋白质发生相互作用。结 合 能 表 示 对 接 的 可 能 性,低 于-20郾 92 kJ/mol通常被认为更有可能结合41。辣木籽抗菌肽与 S.aureus 生物膜形成关键蛋白的分子对接位点见表 2。由表 2 可知,MOp2、MOp3 与这 4 种蛋白的结合能均小于-20郾 92 kJ/mol。辣木籽抗菌肽与 S.aureus 生物膜形成关键蛋白的分子对接结果见图 11。由图 11 可知,MOp2 通过 3个氢键与 AgrA 结合,MOp3 通过 6 个氢键与 AgrA结合;MOp2 通过 3 个氢键与 CshA 结合,MOp3 通过 6 个氢键与 CshA 结合;MOp2 通过 6 个氢键与LuxS 结 合,MOp3 通 过 6 个 氢 键 与 LuxS 结 合;MOp2 通过 2 个氢键与 SarA 结合,MOp3 通过 4 个氢键与 SarA 结合。结果表明:MOp2 与 MOp3 均可能通过氢键与这 4 种蛋白质结合,从而抑制这些蛋白质的表达,最终导致细菌无法黏附和形成生物膜。表 2摇 辣木籽抗菌肽与金黄色葡萄球菌生物膜形成关键蛋白的分子对接分析Tab.2摇 Molecular docking analysis of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides with key biofilm formation proteins of S.aureus肽关键蛋白结合能/(kJ mol-1)氢键数结合位点AgrA-29郾 713ASN鄄18、ARG鄄57、LYS鄄32MOp2CshA-25郾 523ASN鄄292、ASP鄄381、ASN鄄426LuxS-28郾 456PRO鄄78、GLY鄄80、CYS鄄81、ASN鄄46、HIS鄄13、SER鄄8SarA-21郾 762ASN鄄61、ILE鄄6AgrA-30郾 126THR鄄96、GLN鄄95、THR鄄121、THR鄄46、LYS鄄45、ARG鄄44MOp3CshA-21郾 766GLU鄄384、GLN鄄239、ASP鄄381、ASN鄄426、LYS鄄266、ASN鄄292LuxS-26郾 786GLN鄄122、HIS鄄60、HIS鄄56、ARG鄄67、LEU鄄76、GLU鄄59SarA-22郾 184GLU鄄77、SER鄄33、PHE鄄34、LYS鄄69图 11摇 辣木籽抗菌肽与金黄色葡萄球菌生物膜形成关键蛋白的分子对接结果Fig.11摇 Molecular docking results of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides with key biofilm formation proteins of S.aureus111第 41 卷 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 黄志远等:辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌生物膜的影响3摇 结摇 论本研究采用结晶紫半定量法证明了 S.aureusCICC 10384 有很强的生物膜形成能力,而辣木籽抗菌肽 MOp2、MOp3 对 S.aureus 生物膜的 MBIC 和MBEC 均 为 4 mg/mL 和 8 mg/mL,能 有 效 清 除S.aureus生物膜。经 MOp2、MOp3 处理后,S.aureus生物膜黏附减少、细菌数量减少,生物膜菌体新陈代谢能力和生物膜早期形成能力显著下降,细菌初期黏附能力及表面疏水性降低。酶解实验结果表明,S.aureus 生物膜 EPS 中含量最多的为胞外蛋白,其次为胞外多糖和 eDNA,而 MOp2、MOp3 会抑制 EPS中 3 种成分的分泌合成。分子对接结果发现,MOp2、MOp3 均可能通过氢键与生物膜形成关键蛋白 AgrA、CshA、LuxS 和 SarA 结合,这可能导致群体感应系统紊乱,进而导致细菌无法黏附和形成生物膜。研究结果可为辣木籽抗菌肽对 S.aureus 生物膜的影响提供一定的参考,希望为其在食品工业中的进一步应用提供一定的科学依据。接下来的研究将通过蛋白质组学、Western blot、平行反应监测、RT鄄qPCR 等技术针对性地分析 2 种肽抑制生物膜的具体靶点。参考文献:1摇 GUO N,BAI X,SHEN Y,et al.Target鄄based screeningfor natural products against Staphylococcus aureus b