聚乳酸微塑料对大型溞的毒性效应.pdf

中国环境科学 2023,43(8)：43434352 China Environmental Science 刘加强,蒋园园,杨杨阳,等.聚乳酸微塑料对大型溞的毒性效应 J.中国环境科学,2023,43(8):4343-4352.Liu J Q,Jiang Y Y,Yang Y Y,et al.Toxic effects of polylactic acid microplastics to Daphnia magna J.China Environmental Science,2023,43(8):4343-4352.聚乳酸微塑料对大型溞的毒性效应 刘加强1,蒋园园2*,杨杨阳1,程 海2,徐 蕾2,刘 强1,范秀磊1(1.徐州工程学院环境工程学院,江苏 徐州 221111；2.江苏省徐州环境监测中心,江苏 徐州 221000)摘要：为了进一步揭示生物可降解微塑料对水生生物的影响,以大型溞为模式生物,研究了聚乳酸(PLA)微塑料对其急慢性毒性效应.结果表明,PLA 对大型溞的半数效应浓度(48h-EC50)为 59.43mg/L,95%置信区间为 53.5565.97mg/L.经紫外照射处理的 PLA 毒性降低.PLA 对大型溞的游泳活力和摄食行为有浓度依赖性的抑制作用.与对照组相比,100mg/L 的 PLA 显著抑制了大型溞的心率和胸肢活动率,最大抑制率分别为 31.4%和 17.7%.经 21d 长期暴露后,10 和 40mg/L 的 PLA 均一定程度上抑制了大型溞的生殖及内禀增长率(rm),但其影响并不显著.40mg/L 的 PLA 显著降低了大型溞的存活率(仅为20%).PLA的暴露显著诱导了超氧化歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的含量,表明大型溞受到氧化胁迫并引起脂质过氧化损伤.PLA在浓度40mg/L时显著抑制了乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性,从而引起大型溞神经毒性和运动失调.关键词：微塑料；聚乳酸；大型溞；毒性效应 中图分类号：X503.2 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2023)08-4343-10 Toxic effects of polylactic acid microplastics to Daphnia magna.LIU JIA-qiang1,JIANG Yuan-yuan2*,YANG Yang-yang1,CHENG Hai2,XU Lei2,LIU Qiang1,FAN Xiu-lei1(1.School of Environmental Engineering,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221111,China；2.Xuzhou Environmental Monitoring Center Station,Xuzhou 221000,China).China Environmental Science,2023,43(8)：43434352 Abstract：In order to further reveal the effects of biodegradable microplastics on aquatic organisms,the acute and chronic toxic effects of polylactic acid(PLA)microplastics on Daphnia magna were studied using Daphnia magna as the model organism.The results showed that the half effect concentration(48h-EC50)of PLA on Daphnia Magna was 59.43mg/L,with a 95%confidence interval of 53.5565.97mg/L.Additionally,the toxicity of PLA was reduced by ultraviolet irradiation treatment.PLA inhibited the swimming activity and feeding behavior of Daphnia magna in a concentration-dependent manner.Compared with the control group,PLA at 100mg/L significantly inhibited the heart rate and thoracic limb activity of Daphnia magna,with maximum inhibition rates of 31.4%and 17.7%,respectively.After long-term exposure for 21days,both 10 and 40mg/L PLA inhibited the reproduction and intrinsic rate of population growth(rm)of Daphnia magna to some extent,but the effects were not significant.Exposure to PLA at 40mg/L significantly reduced the survival rate of Daphnia magna(only 20%).PLA exposure significantly induced superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content,indicating that Daphnia magna was subjected to oxidative stress and caused lipid peroxidation damage.At the concentration of 40mg/L,PLA significantly inhibited the acetylcholinesterase(AChE)activity,resulting in neurotoxicity and motor disorders of Daphnia magna.Key words：microplastics；polylactic acid；Daphnia magna；toxic effects 微塑料(MPs)在自然环境中普遍存在,由于其粒径小、难降解,在环境中可存在数百至数千年,严重威胁水生态安全和人体健康,成为全球共同面对的一个新问题和挑战.野外调研和室内实验研究表明,水环境中的 MPs 能被水生生物摄入1-2.摄入的微塑料会随着食物链传递,而对不同营养级生物健康产生危害3-4.主要表现在生长抑制、组织损伤、氧化应激、生殖毒性、神经毒性和代谢紊乱等多种毒性效应.传统塑料(如聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等)是稳定的高分子聚合物,环境中难以降解.为了应对传统塑料对环境日益严重的污染,生物可降解塑料(如聚乳酸(PLA)、聚羟基丁酸脂(PHA)和聚丁二酸丁二酯(PBS)等)应运而生,成为了传统塑料的替代品.生物可降解塑料进入环境后短期内会 收稿日期：2023-01-18 基金项目：江苏省生态环境保护地下水监测监控与污染预警重点实验室开放课题(GWKL2203);江苏省科技副总项目(FZ20210338);国家自然科学基金资助项目(52000153)*责任作者,高级工程师, 4344 中 国 环 境 科 学 43 卷 产生大量微塑料,从而对水生态系统产生影响.有研究发现,PLA 较 PET 更容易被斑马鱼摄入,摄入的PLA 会对斑马鱼造成肠道损伤,并引起肠道菌群结构和功能的特异变化5.PVC 和 PLA 都会对大型溞的生长、繁殖产生负面影响,PVC 的影响主要归因于材料中的添加剂,而 PLA 的影响是由颗粒本身引起的6.与传统 MPs 相比,生物可降解 MPs 有着不同的结构和性质,同时其短期内能够产生显著的变化,与其他共存污染物的相互作用与传统 MPs 相比也不尽相同.在毒性效应方面,生物可降解 MPs 对水生生物的影响与传统 MPs 相比也必然有着显著差异.生物可降解 MPs 可能与传统 MPs 一样有毒,然而目前生物可降解 MPs 对水生生物的生态风险仍在很大程度上未知,有待进一步研究.为了揭示生物可降解 MPs 暴露对水生生物的毒理学效应,本文选取模式生物大型溞为受试生物,以使用最广泛的生物可降解塑料 PLA 为研究对象,通过急性和慢性毒性实验,探究 PLA 对大型溞生长发育、生殖、游泳和摄食等生态行为学指标的影响,分析大型溞抗氧化系统和神经系统酶活性的变化以及脂质代谢系统的影响,以期为 PLA 污染的风险预测和合理防控提供参考.1 材料与方法 1.1 实验材料和仪器 大型溞购自中国科学院水生生物研究所.实验选用 Elendt M4 标准稀释水7作为培养液.培养条件为温度(201C),光暗比 16h:8h,光照强度为 1200lx.培养液每周更换 2 次,以小球藻为食物,每天一次,喂食密度为 105cells/mL.PLA 购自华创塑胶公司(4032D,纯度约 98%,350 目),由美国 NatureWorks 公司生产.总蛋白(TP)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所.紫外老化 PLA(UV-PLA)暴露液的制备过程如下,称取一定量 PLA 微塑料样品放入石英管中与 100mL 培养液充分混合后,将石英管置于装有UVA-340 紫外灯的老化装置中,装置中设有磁力搅拌器(设置转速为 200r/min),可使石英管中的PLA 完全混合.在紫外线波长 340nm,强度为2.8mw/cm2下进行 24h 紫外老化试验,试验结束后的 PLA 混合液用于急性毒性暴露实验.另外,将部分老化结束后的 PLA 暴露液用 0.45m 玻璃纤维滤膜(预先 450灼烧 5h)过滤,并将滤膜于干燥箱中 30条件下干燥 24h,干燥后的 PLA 样品用于相关表征测试,过滤液进行总有机碳(TOC)测定.PLA 暴露液的制备过程同上,所不同的是无紫外灯照射.采用扫描电子显微镜(SEM,Hitachi S-4800,日本)观察 PLA 和 UV-PLA 表面形态,采用 KBr 压片法在傅里叶变换红外光谱仪(FTIR,Nicolet is10,美国)上分析了PLA和UV-PLA的官能团变化,采用激光粒度仪(Malvern Mastersizer 2000,英国)测量了PLA 和 UV-PLA 的粒径分布,采用差减法在总有机碳分析仪(岛津 TOC-VCPH,日本)上分析了 PLA 和UV-PLA 混合液中 TOC 含量.1.2 急性毒性实验 参照 OECD202 标准方法分别进行 PLA/UV-PLA 混合液的急性毒性暴露试验8.依据Zimmermann 等6研究中 PLA 浓度设置范围,并在预实验的基础上设置 6个暴露组(PLA/UV-PLA浓度分别为 10,20,40,80,100,200mg/L)和 1 个空白对照组(不添加 PLA),每个处理组 3 个平行.实验中,在 100mL 烧杯中加入 50mL 培养液,随机加入 10只溞龄在 624h 的健康幼溞,期间不投喂、不更换培养液.暴露 24h、48h 后分别记录每个烧杯中幼溞的抑制率.1.3 游泳活力测定 48h 暴露结束后,取大型溞活体置于 6 孔培养皿中,每孔 1 只,逐个进行追踪.每孔中暴露溶液 1.5cm高,以保证生物只发生二维平面的位移.适应 5min后,使用数码相机以每 s 30 帧的速度记录下每只大型溞的运动轨迹,持续 1min.然后使用图像处理软件Tracker5.1.5 对视频进行分析.设置比例尺和坐标原点后,逐帧对大型溞的坐标进行捕捉,绘制出大型溞的运动轨迹,并逐帧计算其平均速度 v 和加速度a.每个处理组取 10 只大型溞,其均值为该处理组的最终结果.1.4 摄食率的测定 根据 Zhu 等9的方法进行摄食试验.48h 暴露结束后,随机挑选20只大型溞转移到含有小球藻(初始8 期 刘加强等：聚乳酸微塑料对大型溞的毒性效应 4345 密度约为 1106cells/mL)的暴露液中,黑暗条件下暴露 5h.利用血球计数板计数的方法分别测定暴露前和暴露结束时小球藻密度,每个处理组重复 3 次.计算滤水率(F)和摄食率(I):0lnlntCCvFAnt=(1)0(lnln)/tACCt=(2)0tIFCC=(3)式中:C0和 Ct分别代表起始和终点小球藻的浓度,cell/mL;t为暴露时间,h;n为大型溞的个数;V 为暴露液体积,mL;Ct为对照组终点小球藻浓度,cell/mL;A为校正因子.1.5 心跳速率和胸肢活动率测定 48h暴露结束后,用吸管将大型溞转移至载玻片上,滴入适量暴露溶液.将载玻片置于配备CCD摄像机的光学显微镜下观察,捕捉其心脏和胸肢,生物适应 1min 后,对其心跳和胸肢活动进行 60s 的录像.然后使用计数器对录像结果进行大型溞跳动次数的计数,每个视频计数3次.每个处理组取 5只大型溞,其均值作为该处理组的最终结果.1.6 慢性毒性实验 参考 OECD211 标准方法进行 21d 慢性毒性实验7,根据急性毒性实验结果中 48h-EC50值,慢性毒性实验设置了低、高 2 个暴露组(PLA 浓度为 10 和40mg/L)以及空白对照组(不添加 PLA).试验在100mL 烧杯中进行,每个烧杯放入 1 只健康幼溞(624h)和 50mL 培养液,每个处理组设置 10 个重复,用于生殖实验.另在装有800mL暴露溶液的1000mL烧杯中随机挑选 200 只健康幼溞(624h),用于抗氧化损伤实验.在实验期间,每天投喂小球藻(密度为105cells/mL),每2d更换一次培养液,并每天记录大型溞的存活数、产溞数,死亡数,挑出新生幼溞,直到21d结束.实验结束后,统计首次产溞时间、首次产溞数、单雌产溞数和产胎数等数据,并计算内禀增长率rm10.另外,21d 暴露结束后,测定 SOD、T-AOC、AChE 的活性和 MDA 的含量,测试方法参考试剂盒中提供的进行.1.7 数据分析 采用 SPSS 25.0 进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和 Tukeys 多重比较检验.数据结果表示为(平均值标准差),P0.05 表示存在显著性差异.数据绘图采用 GraphPad Prism 8 和 Origin 2018 实现.2 结果与讨论 2.1 聚乳酸(PLA)的特征 PLA 的 SEM 图像如图 1(ab)所示,整体大小不一、形状极不规则;表面粗糙呈鳞片状并伴有裂缝;经紫外线老化处理的 PLA 如图 1(cd)所示,在形貌上并未发现明显的变化.在 PLA 浓度为200mg/L 时,其粒度分布如图 2(a)所示,d(0.1),d(0.5)和 d(0.9)分别为 3.089,18.085 和 71.567m;对应的UV-PLA 粒度分布如图 2(b)所示,d(0.1),d(0.5)和d(0.9)分别为 3.039,15.675 和 52.302m,表明分别有 10%,50%和 90%的颗粒小于等于相应粒径.粒径的减小说明紫外老化作用加速了 PLA 的降解.大型溞是滤食性生物,Kokalj 等11的研究表明,大型溞能够摄食粒径范围 0.770m 的微塑料.大型溞因误食微塑料,产生错误的饱腹感,影响其生长发育,从而减少生物多样性.图 1 PLA 和 UV-PLA 的 SEM 图像 Fig.1 SEM micrographs of PLA and UV-PLA 在2996,1757,1385,1088cm-1处观察到PLA的典型红外吸收峰12,如图 3 所示.在 2996cm-1处的吸收峰代表甲基 C-H 的伸缩振动13,1757cm-1处的吸收峰与酯基 C=O 的伸缩振动有关14,1385cm-1附近的吸收峰是由甲基 C-H 的弯曲振动引起的14,在1088cm-1处观察到非对称桥接 C-O-C 的伸缩振动 15,表明分子中存在环状内酯结构16.此外,在1620cm-1附近的吸收峰是由羰基 C=O 的伸缩振动引起的17,这可能是由于PLA中的添加剂引起的18.UV-PLA 相应特征峰的强度明显降低,进一步证实PLA 发生了降解.4346 中 国 环 境 科 学 43 卷 (a)PLA 累计分布(%)颗粒(m)累计分布 微分分布 微分分布(%)(b)UV-PLA 累计分布(%)颗粒(m)微分分布(%)图 2 PLA 和 UV-PLA 在 200mg/L 时的粒度分布 Fig.2 The particle size distribution of PLA and UV-PLA at 200mg/L 波数(cm-1)图 3 PLA 和 UV-PLA 的 FT-IR 光谱 Fig.3 FT-IR spectra of PLA and UV-PLA 不同浓度 PLA 暴露溶液中 TOC 浓度及释放率如图4所示,总有机碳(TOC)浓度随着PLA暴露溶液浓度的增加而增加.由图 4(a)所示,PLA 浓度与 TOC浓度之间存在显著线性正相关(P0.05),相关关系R2为 0.998;Belehradek 方程能够较好的描述 PLA 释放TOC 的过程,相关系数 R2为 0.945;由图 4(b)所示,对应浓度下UV-PLA溶液TOC浓度均高于PLA,相应增加了 0.0171.36 倍.同样的,UV-PLA 浓度与 TOC浓度之间为显著线性正相关(P0.05),相关关系 R2为 0.993,TOC 释放率用 Belehradek 方程拟合的相关系数 R2为 0.996.PLA 浸出释放的有机物质,可能影响到大型溞的毒性效应.TOC 浓度(mg/L)(a)PLATOC 浓度TOC 释放率TOC 释放率(%)PLA 浓度(mg/L)y=12.596(x-10)-0.0115 TOC 浓度(mg/L)(B)UV-PLATOC 浓度TOC 释放率TOC 释放率(%)PLA 浓度(mg/L)y=69.992(x-7.732)-0.335 图4 不同浓度下PLA 和UV-PLA 暴露液中TOC 浓度及释放率 Fig.4 TOC concentration and release rate in PLA and UV-PLA exposure solution under different concentrations 2.2 PLA 暴露对大型溞活动抑制的影响 在暴露过程中,空白组大型溞未发现受到抑制的情况.PLA单独暴露对大型溞的活动抑制率如图5所示,结果表明,随着暴露时间的增加,大型溞的活动抑制率也随之增加.如图 5(a)所示,PLA 对大型溞的活性抑制率呈浓度依赖性增加,当浓度为 200mg/L时,48h活动抑制率接近100%,表明高浓度PLA对水环境中大型溞的活动能力产生更不利影响.根据四参数 Logistic 模型对数据进行非线性曲线拟合得到浓度-效应关系曲线和 EC50如图 5(b)所示.暴露 24 和 48h,浓度-效应关系均成“S”型曲线.PLA 对大型溞 24 和 48h 的 EC50值分别为 83.12 和59.43mg/L,95%的置信区间分别为 70.4398.09 和8 期 刘加强等：聚乳酸微塑料对大型溞的毒性效应 4347 53.5565.97mg/L.Zimmermann 等6研究了不规则微塑料 PVC、聚氨酯(PUR)、PLA 和高岭土暴露对大型溞 21d 的慢性毒性影响,发现所有类型微塑料(59m)都降低了大型溞后代的繁殖数量,其影响水平因塑料类型而异,PVC、PLA、PUR 和高岭土的EC50分别为 45.5,122,236 和 275mg/L,PVC 对生殖的危害最大.Yuan 等19研究了两种尺寸的聚苯乙烯微塑料(10 和 50m)单独暴露对大型溞活动抑制的影响,发现大、小粒径微塑料 48h 的 EC50分别为238.490 和 174.574mg/L.Frydkjaer 等20的研究结果表明,聚乙烯(1075m)对大型溞 24h 的 LC50为65mg/L.微塑料暴露对大型溞有毒性作用,而毒性效应受其物理化学性质的影响,包括粒径、形状和化学成分.图 5 PLA 单独暴露对大型溞的活动抑制率 Fig.5 Effects of PLA alone on the immobilization of D.magna n.d.为未检出 2.3 UV-PLA 对大型溞活动抑制的影响 UV-PLA 单独暴露对大型溞活动抑制率的影响如图 6 所示,当暴露浓度为 200mg/L 时,48h 活动抑制率最高也仅为 10%,说明紫外老化作用对 PLA起到解毒作用.紫外老化加速了 PLA 的水解过程.PLA 的降解途径多种多样,其中水解是最基本的降解途径21.PLA 通过酯键水解降解成乳酸22,乳酸在三元酸循环中转化为丙酮酸,最终以 H2O 和 CO2的形式排放23.Duan 等24的研究发现由于 PLA 降解过程中产生的乳酸可能会改变斑马鱼肠道内环境的 pH 值平衡,从而对其肠道可能产生更大的不良影响.然而,经紫外老化的 PLA 对大型溞的毒性效应降低,一种可能的解释是 PLA 水解过程产生的乳酸可以被大型溞作为碳源或者能源利用.在最近的一项研究中,研究人员也提出生物可降解微塑料作为不稳定的碳源,刺激微生物的生长和土壤氮磷循环25.图 6 UV-PLA 单独暴露对大型溞的活动抑制率 Fig.6 Effects of UV-PLA alone on the immobilization of D.magna n.d.为未检出 2.4 PLA 对大型溞游泳和摄食行为的影响 大型溞的游泳行为是复杂的、多参数的,被认为是最敏感的毒性生物标志物之一,受到其生理、感知、神经和肌肉系统等多方面的影响26.描述大型溞的行为活动,游泳速度是最可靠、最广泛的应用参数之一.Hansen 等27又提出了加速度作为另一个与游泳速度有关的参数.大型溞暴露在不同浓度的 PLA 溶液中,游泳速度和加速度均显示出浓度依赖性的抑制如图 7 所示.研究表明,多种物质可以影响大型溞的游泳速度.二氧化钛,碳基纳米材料(例如多壁碳纳米管,石墨烯,氧化石墨烯,碳富勒烯)对大型溞游泳速度的抑制作用均呈现浓度依赖性28-30.这与本文的研究结果是类似的.与空白组相比,10mg/L 的 PLA 单独4348 中 国 环 境 科 学 43 卷 暴露导致大型溞游泳速度降低,但没有显著性差异.而随着暴露浓度的增加,PLA 对大型溞游泳速度的影响表现为显著抑制作用(P0.05).当 PLA 浓度增加到100mg/L时,游泳速度降至最低,比空白显著抑制了 65.34%.所有暴露组的加速度均受到显著抑制,100mg/L 时抑制率最高为 62.5%.Stanley 等31的研究中提到较高浓度的多壁碳纳米管被发现会降低大型溞的活动能力,但较低浓度的碳纳米管不会影响大型溞的活动能力.从图 8 可以看出,PLA 主要附着在大型溞的壳刺、触角、尾刚毛、吻、胸肢表面.由于PLA密度(1.21.3g/cm3)较大,附着在大型溞表面的 PLA 会增加大型溞的自重,从而会限制大型溞的正常生理活动,如游动和摄食,进而间接导致大型溞的抑制或死亡.另外,游泳速率的变化会改变食物链中不同营养级之间的关系从而会影响两个物种之间的生存状况32.大型溞游泳行为受到抑制,不仅影响到其自身的摄食能力,其被捕食的风险也会增大.相对游泳速度(%)相对加速度(%)PLA 浓度(mg/L)相对游泳速度 相对加速度 图 7 PLA 单独暴露下大型溞的相对游泳速度和加速度 Fig.7 The relative swimming velocity and acceleration of D.magna in the exposure of PLA alone 不同大写和小写字母分别表示组间存在显著性差(P0.05),以下同 大型溞作为滤食性生物,主要通过体表吸附和滤食作用摄入外源性物质.PLA 单独暴露下大型溞的滤水率和摄食率如图 9 所示.随着 PLA 暴露浓度的增加,大型溞的滤水率和摄食率均呈浓度依赖性降低.而低暴露浓度(10 和 20mg/L)下,大型溞的摄食率和滤水率与对照组无显著性差异,暴露于高浓度(40,80,100mg/L)的大型溞摄食率和滤水率显著降低(P0.05).本研究中 90%的 PLA 颗粒粒径小于72n,可通过非选择性摄食进入大型溞体内.进入大型溞体内的微塑料会在其消化道内积累,导致消化系统功能障碍,食物摄取量降低,从而限制了大型溞的能量吸收33.摄食量的限制也可能直接关系到大型溞的生长和繁殖34.Pan 等35的研究进一步证实了这一点,在亚致死剂量范围内聚乙烯微塑料能够使大型溞的心跳频率、跳跃频率和滤食效应降低,长期接触聚乙烯微塑料会增加大型溞被捕食的风险并降低其繁殖能力,最终对浮游生物生态系统的稳定性和持久性产生影响.图 8 大型溞在 PLA 溶液中暴露 48h 后的光学显微镜图像 Fig.8 Optical microscopy images of D.magna exposed to PLA solution for 48h 滤水率(ml/ind/h)摄食率(106cell/ind/h)PLA 浓度(mg/L)滤水率 摄食率 图 9 PLA 单独暴露下大型溞的滤水率和摄食率 Fig.9 Filtration and ingestion rates of D.magna in the exposure of PLA alone 2.5 PLA 对大型溞心率和胸肢活动的影响 心率和胸肢活动是大型溞毒理学研究中非常敏感的生理指标,能够反映污染物对大型溞呼吸、血液循环系统、代谢速率和摄食的影响程度36.8 期 刘加强等：聚乳酸微塑料对大型溞的毒性效应 4349 心率 胸肢活动率PLA 浓度(mg/L)心率和胸肢活动率(次/min)图 10 PLA 单独暴露下大型溞的心率和胸肢活动率 Fig.10 Heart rate and thoracic limb activity of D.magna in the exposure of PLA alone 由图10可见,不同浓度 PLA 暴露下大型溞心率和胸肢活动率相比于空白均受到抑制,平均抑制率分别为 10.5%31.4%和 1.0%17.7%,最大抑制率出现在暴露浓度为 100mg/L 时,且存在显著性差异(P0.05).心率抑制可能是高浓度 PLA 暴露导致大型溞抑制甚至死亡的主要原因.大型溞有着与哺乳动物类似的肌源性心脏,外源污染物胁迫引起其心率变化的反应与哺乳动物相似,且不同物质表现出的反应不同37.研究表明38,不同粒径(20 和 30m)的聚乙烯微塑料导致大型溞存活率和心率显著下降,20m 微塑料主要影响磷脂代谢,30m 微塑料主要诱导降解氨基酸代谢产物,进而影响能量代谢.胸肢作为大型溞的摄食器官,受到心脏的能量供给和神经系统调控的双重作用完成摄食动作39.PLA 暴露引起大型溞心率降低,减弱了其能量代谢,导致供给胸肢活动的能量减少,使胸肢活动频率下降,摄食不足,最终对其生长发育构成威胁.2.6 PLA 对大型溞生殖及种群增长的影响 图 11(e)为 21d 暴露后大型溞的存活率,PLA 暴露浓度为 40mg/L 时存活率最低为 20%,且与对照组相比存在显著差异(P0.05).同时,暴露浓度为10mg/L时与空白组无差异,存活率均为80%.PLA对大型溞生殖指标的影响如图 11(ad)所示,与对照组相比,高、低两个暴露组均引起大型溞的首次产溞时间略微提前以及首次产溞数、单雌产溞数和产胎数的降低.PLA 的暴露在一定程度上抑制了大型溞的生殖能力,其中高浓度组的抑制作用略强,但抑制作用并不显著.研究表明,3 种微塑料(PVC、PUR 和PLA)都对大型溞的生活史产生了负面影响,其中PVC 对大型溞繁殖的影响最大,PLA 对存活率的影响最大,并将 PVC 的影响归因于材料中使用的化学物质,而 PUR 和 PLA 是由颗粒本身引起的6.暴露浓度(mg/L)暴露浓度(mg/L)暴露浓度(mg/L)图 11 PLA 对大型溞的慢性毒性 Fig.11 Chronic toxicity of PLA to D.magna 种群内禀增长率(rm)反映了种群的生殖能力,是研究污染物慢性毒性的重要指标40.为了综合评价4350 中 国 环 境 科 学 43 卷 PLA 对大型溞慢性毒性的影响,基于大型溞的存活率、产溞数和日龄等生殖参数计算了 rm.如图 11(f)所示,尽管对照组与暴露组之间无显著差异,但在高、低两个暴露组下,大型溞种群增长率都受到抑制.结果进一步证明,PLA 暴露可能会对种群扩张速度产生不利影响.类似的,原始聚苯乙烯和紫外线老化的聚苯乙烯微塑料都降低了大型溞的rm值,其中紫外线老化的聚苯乙烯微塑料影响更严重10.世代持续接触微塑料可能会导致种群灭绝41.2.7 PLA 对大型溞抗氧化和神经系统的影响 微塑料在生物中的氧化应激毒性主要通过细胞中产生活性氧(ROS)而引起的氧化应激反应,引发细胞受损,从而降低生长率和繁殖力42.正常生理状态下,大型溞体内的活性氧产生和清除处于动态平衡.然而,由于微塑料在大型溞体内的积累和停留导致正常摄食受阻,摄食率降低会引起氧化应激酶的变化43.本研究选择 T-AOC、SOD 和 MDA 作为评估氧化应激的重要指标.超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内存在的一种抗氧化金属酶,能够歧化超氧化物自由基形成 H2O2和 O2,在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用44.从图 12 可以看出,高、低两个 PLA暴露组的 SOD 活性均显著升高(P0.05),且高浓度暴 露 组 的 诱 导 作 用 显 著 高 于 低 浓 度 暴 露 组(P0.05),诱导率达到了 49%.SOD 被激活以减少大量的 ROS,细胞内的 T-AOC 增强了对有毒自由基的抵抗.丙二醛(MDA)作为脂质过氧化的产物,可以间接反映 ROS 过量产生的程度45,MDA 含量的增加,说明机体内抗氧化防御系统遭破坏,打破了抗氧化酶清除和活性氧的产生之间的平衡,造成过多的ROS 积累,引起脂质过氧化损伤46.相关研究也表明,微塑料对水生动物造成氧化应激,如大型溞10,藻类47,斑马鱼48等.在氧化损伤方面,高浓度组的MDA 含量显著高于对照组(P0.05).同时,低浓度组与空白组间无差异,表明低暴露浓度下诱导的氧化应激反应有限.T-AOC 可反映机体整体抗氧化水平上自由基的清除能力49,包括抗氧化酶、抗坏血酸和谷胱甘肽等.从图 12 可见,T-AOC 在暴露组与空白组间并无显著差异,这也是高浓度暴露组MDA 过度积累的原因.乙酰胆碱酯酶(AChE)是生物神经传导中的一种关键酶,它能将神经递质乙酰胆碱分解成乙酸和胆碱50.从图 12 可见,与对照组相比,高、低两个暴露组的 AChE 均降低,且高浓度组存在显著性差异.相关研究也发现微塑料暴露可通过抑制生物体体内乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性,进而引起神经毒性和运动失调51-52.AChE酶活性受到抑制会导致神经刺激延长,引起心率、游泳活性降低53.乙酰胆碱酯酶活性的抑制改变了不同的行为终点,进而影响暴露生物的适应和生存.图 12 21d 暴露后大型溞体内 AChE、抗氧化酶(T-AOC、SOD)活性和 MDA 含量的相对变化 Fig.12 Relative changes of AChE,antioxidant enzymes(T-AOC,SOD)activity and MDA content in D.magna after 21d exposure 3 结论 3.1 PLA 对大型溞的 24h-EC50值为 83.12mg/L,95%置信区间为 70.4398.09mg/L;48h-EC50值为59.43mg/L,95%置信区间为 53.5565.97mg/L.紫外照射对 PLA 起到解毒作用.3.2 PLA 对大型溞游泳活力和摄食行为具有浓度依赖性的抑制作用.游泳行为受到抑制,不仅影响到其自身的摄食能力,其被捕食的风险也会增大.100mg/L的PLA显著抑制了大型溞的心率和胸肢活动率,最大抑制率分别为 31.4%和 17.7%.3.3 21d 长期暴露,PLA 一定程度上抑制了大型溞的生殖及内禀增长率(rm),但其影响并不显著.PLA浓度 40mg/L 时大型溞的存活率显著降低.PLA 的暴露显著诱导了 SOD 的活性和 MDA 的含量,表明大型溞受到氧化胁迫并引起脂质过氧化损伤.AChE的显著抑制,导致大型溞神经毒性和运动失调.8 期 刘加强等：聚乳酸微塑料对大型溞的毒性效应 4351 参考文献：1 Grigorakis S,Mason S A,Drouillard K G.Determination of the gut retention of plastic microbeads and microfibers in goldfish(Carassius auratus)J.Chemosphere,2017,169:233-238.2 Wang J,Wang M,Ru S,et al.High levels of microplastic pollution in the sediments and benthic organisms of the South Yellow Sea,China J.Science of The Total Environment,2019,651(Part 2):1661-1669.3 邵雪纯,胡双庆,张 琪,等.聚乳酸微塑料及其复合污染的生物毒性效应与机制研究进展 J.中国环境科学,2023,43(2):935-945.Shao X C,Hu S Q,Zhang Q,et al.Research progress on biotoxicological effects and mechanism of polylactic acid microplastics and their combined pollution J.China Environmental Science,2023,43(2):935-945.4 张子琪,高淑红,康园园,等.中国水环境微塑料污染现状及其潜在生态风险 J.环境科学学报,2020,40(10):3574-3581.Zhang Z Q,Gao S H,Kang Y Y,et al.Current status of microplastics contamination in Chinas water environment and its potential ecological risks J.Acta Scientiae Circumstantiae,2020,40(10):3574-3581.5 Duan Z,Cheng H,Duan X,et al.Diet preference of zebrafish(Danio rerio)for bio-based polylactic acid microplastics and induced intestinal damage and microbiota dysbiosis J.Journal of Hazardous Materials,2022,429:128332.6 Zimmermann L,Gttlich S,Oehlmann J,et al.W