聚合酶链反应系统检测人巨细胞病毒DNA的性能验证及评价.pdf

学术论著ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI 39中国医学装备2023年8月第20卷第8期 China Medical Equipment 2023 August Vol.20 No.8*基金项目：军队生物安全研究专项资助项目(19SWAQ06)“超级细菌生物学特性及防控技术的研究”解放军总医院第五医学中心南院区检验科 北京 100073*通信作者：； 作者简介：袁方，女，(1989-)，本科学历，主管技师，从事医院分子诊断技术及研究工作。文章编号 1672-8270(2023)08-0039-05 中图分类号 R446 文献标识码 APerformance verification and evaluation of PCR system in detecting HCMV DNA/YUAN Fang,TONG Li-wei,YAN Yan,et al/China Medical Equipment,2023,20(8):39-43.Abstract Objective:To conduct performance verification and evaluation of real-time fluorescent quantitative-polymerase chain reaction(FQ-PCR)system in detecting human cytomegalovirus deoxyribonucleic acid(HCMV DNA)so as to satisfy the demands of clinical detection.Methods:The clinical samples of hospital and the standard samples provided by third party were collected,and the real-time FQ-PCR system was adopted to detect the performance of HCMV DNA reagent and conduct evaluation.The accuracy,measurement precision(intra batch repeatability and inter batch precision),linear interval,detection limit,anti-interference ability,cross reaction and other performance of the detection method of HCMV DNA FQ-PCR system were verified and evaluated according to the corresponding requirements of the series of documents of and of China National Accreditation Service for Conformity Assessment,and the EP series files of Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)of American.Results:The accuracy of FQ-PCR system was within the permissible range in detecting HCMV DNA,and the coefficients of variation(CVs)of precision of intra batch repeatability of low and high concentrations samples(1.72E+04copies/ml and 2.74E+09 copies/ml)were respectively 3.90%and 0.11%,and the inter batch precision CVs of them were respectively 4.05%and 0.94%.The linear relationship was favorable within the range between 4.00E+02 and 4.00E+09 copies/ml(R2=0.999),which met the requirements.The lower limit of detection could reach to 4.00E+02 copies/ml,and the absolute deviations between the detective results of the interferences(total bilirubin,triglycerides and hemoglobin)and the control sample were log0.4.The detective results of cross reactions of pathogens hepatitis B virus,hepatitis C virus,herpes simplex virus,human herpesvirus type 4(EB virus),human papillomavirus type 6/11)were negative.Conclusion:The each performance indicator of the FQ-PCR detection method of HCMV DNA is consistent with the statement of the manufacturer,which can be used in clinical detection.Key words Human cytomegalovirus(HCMV);Deoxyribonucleic acid(DNA);Performance verification;Real-time fluorescence quantitationFirst-authors address Qinghai Provincial Drug Inspection and TesLaboratory,The South Branch of the Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital,Beijing 100073,China.摘要 目的：利用实时荧光定量-聚合酶链式反应(FQ-PCR)系统检测人巨细胞病毒脱氧核糖核酸(HCMV DNA)的性能验证及评价，以满足临床检测需要。方法：收集医院临床样本及第三方提供的标准品，采用实时荧光定量PCR系统检测HCMV DNA试剂的性能及进行评价。依据中国合格评定国家认可委员会发布的分子诊断检验程序性能验证指南(CNAS-CL039)临床化学定量检验程序性能验证指南(CNAS-GL037)及美国临床和实验室标准化协会(CLSI)扩展(EP)系列文件相关要求对实验室HCMV DNA FQ-PCR系统的检测方法的正确度、测量精密度(含测量批内重复性和测量批间精密度)、线性区间、检出限、抗干扰能力、交叉反应等性能进行验证及评价。结果：荧光定量PCR系统检测HCMV DNA的正确度在允许范围内；低浓度(1.72E+04 copies/ml)、高浓度(2.74E+09 copies/ml)样本批内重复性测量精密度变异系数(CV)分别为3.90%和0.11%，批间测量精密度CV分别为4.05%和0.94%；在4.00E+024.00E+09 copies/ml范围内线性关系良好(R2=0.999)，符合要求；检测下限可以达到4.00E+02 copies/ml；干扰物(总胆红素、甘油三脂、血红蛋白)样本检测结果与对照样本绝对偏差log0.4；交叉反应病原体乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人类疱疹病毒4型、人乳头瘤病毒6/11型检测结果均为阴性。结论：HCMV DNA荧光定量PCR检测方法的各项性能指标与厂家声明相符，可用于临床检测。关键词 人巨细胞病毒；脱氧核糖核酸(DNA)；性能验证；实时荧光定量DOI:10.3969/J.ISSN.1672-8270.2023.08.008引用本文：龙存林,王允建,雷迪,袁方,佟利威,闫研,等.聚合酶链反应系统检测人巨细胞病毒DNA的性能验证及评价J.中国医学装备,2023,20(8):39-43.袁 方 佟利威 闫 研 吴海涵 李浩桐 陈能能 李好莲 李 波*李伯安*聚合酶链反应系统检测人巨细胞病毒DNA的性能验证及评价*人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是一种普遍存在的疱疹病毒，为双链DNA病毒，发达国家人群HCMV的感染率为40%60%，发展中国家感染率更高，我国成年人感染率可高达40 ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI学术论著95%以上1。HCMV多数感染者为亚临床症状和潜伏感染，但在一定条件下可急性发作导致严重后果，尤其在免疫功能减弱的情况下，如血液病、器官移植患者等2-5。由于HCMV及其复杂，且缺乏相关动物模型，HCMV高隐形感染和活动性感染患者无典型临床症状，给HCMV感染的临床诊断带来很大困难6-7。确诊HCMV感染检测手段有很多，但目前实时荧光定量-聚合酶链反应(fluorescent quantitative-polymerase chain reaction，FQ-PCR)检测以早发现、易操作等优势在临床上被广泛应用，但对于核酸检测结果的灵敏度、准确性，需要从标本类型、质量、实验因素、试剂盒性能等因素来综合分析，尤其对难诊断的病例应当更严格控制8。性能验证是保证实验室开展的检验项目所应用的检测系统分析性能或检验项目的方法学能够满足检测及临床需求，保证患者标本检测结果准确可靠所进行的一系列验证试验9。为此，本研究采用聚合酶链反应检测仪对HCMV DNA实时荧光定量检测的性能进行验证，以满足医院临床检测需要。1 材料与方法1.1 标本来源 收集2022年7月解放军总医院第五医学中心南院区检验科低浓度(1.72E04 copies/ml)、高浓度(2.74E09 copies/ml)临床乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝全血阳性样本，用于测量试剂批内、批间精密度验证；另收集高浓度(4.00E09 copies/ml)EDTA抗凝全血阳性样本，用于线性区间验证，低浓度(1.39E04 copies/ml)临床EDTA抗凝全血阳性样本用于抗干扰能力验证；工作标准品(批号：20220808)用于正确度验证，由湖南圣湘科技股份有限公司提供，浓度标准品(编号：090677)用于检出限验证，由广州邦德盛生物科技有限公司提供；均保存于-20 冰箱。1.2 仪器与试剂采用SLAN-96P型荧光定量PCR仪(湖南圣湘生物科技有限公司)；HCMV-DNA定量检测试剂盒(批号：2022005，湖南圣湘生物科技有限公司)；浓度标准品(编号：090677，广州邦德盛生物科技有限公司)。1.3 性能验证方法依据中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service，CNAS)制定的分子诊断检验程序性能验证指南(CNAS-CL039)10临床化学定量检验程序性能验证指南(CNAS-GL037)11并参考美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)扩展(extended play，EP)系列文件及相关文献12-13对HCMV DNA检测系统的正确度、测量精密度(含测量批内重复性和测量批间精密度)、线性区间(可报告区间)、检出限、分析特异性(含抗干扰能力、交叉反应)等性能特征进行验证及评价，以保证检测结果的准确可靠，符合临床需求。1.3.1 DNA提取与PCR反应严格按照HCMV DNA试剂盒说明书的要求进行操作，反应循环参数：50，2 min，循环1次；94，5 min，循环1次；94，15 s，57，30 s采集荧光，循环45次；25，10 s，循环1次。FQ-PCR反应结束后经过分析调节图像基线(baseline)以及阈值线(threshold)值，使各项参数符合质量控制要求，方可记录定量结果。1.3.2 正确度验证 参照CNAS-GL037文件11要求，选取湖南圣湘科技股份有限公司提供的高、中、低3个浓度水平的工作标准品各1例，每个浓度水平的标准品样本，每日重复测定2次，连续测定5 d，总计重复10次，记录检测结果并计算log值，分别统计3个浓度水平标准品log值的均值(X)，再计算绝对偏差；根据国家卫健委临床检验中心室间质评要求，可接受标准为绝对偏差log0.4。1.3.3 测量精密度验证 测量精密度验证含测量批内重复性和测量批间精密度，参照CNAS-GL037文件11要求，选取医院低浓度(1.72E04 copies/ml)、高浓度(2.74E09 copies/ml)两个EDTA抗凝全血临床样本各1例，每例样本使用同一批号试剂重复测定20次，作为测量重复性精密度；将低、高两个浓度临床样本，在同一批试验中每日重复测定4次，连续测定5 d，总计重复20次，作为测量中间精密度，记录测定结果并计算log值，分别统计两个浓度临床样本log值的均值(X)和标准差(standard deviation，SD)，再计算变异系数(coefficient of variance，CV)；以能力验证或室间质评评价界限(靶值log0.4)作为允许总误差(TEa)，可接受标准为CV5%，测量批内重复性精密度3/5 TEa(0.24)，测量批间中间精密度4/5 TEa(0.32)。中国医学装备2023年8月第20卷第8期 聚合酶链反应系统检测 人巨细胞病毒DNA的性能验证及评价*-袁 方 等学术论著ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI 411.3.4 线性区间验证 参照CNAS-GL037文件11要求，选取高浓度(4.00E09 copies/ml)临床样本1例，进行10倍梯度稀释达到或接近试剂盒标明的定量检测线(高限：4.00E09 copies/ml，低限：4.00E02 copies/ml)，每个浓度重复检测3次，记录检测结果并计算log值，分别统计每个浓度水平log值的均值，以实测浓度log均值为X轴，理论浓度log值为Y轴，绘制拟合曲线，计算线性相关系数(R2)值；可接受标准为R20.980。1.3.5 检出限验证 参照CNAS-GL039文件10要求，选取浓度标准品(编号：090677)稀释至厂家声明的检出限浓度(4.00E02copies/ml)，每日重复测定5次，连续测定5 d，总计重复25次，记录检测结果；可接受标准为阳性检出率100%。1.3.6 抗干扰能力验证 参照CNAS-GL03910文件要求，将制备的干扰物质甘油三酯(600 mmol/L)、总胆红素(30 mmol/L)、血红蛋白(2 000 g/L)溶液，及正常对照HCMV DNA阴性样本，按1100混入HCMV DNA阳性(1.39E04 copies/ml)样本中，与常规样本一样处理，重复测定3次，记录测定结果并计算log值，分别统计测试样本和对照样本log均值绝对偏差；可接受标准为绝对偏差log0.4。1.3.7 交叉反应验证 参照CNAS-GL03910文件要求，选取200l与HCMV DNA具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体(乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒6/11型)标本，加入200l经确认的阴性标本中充分混匀，所有的病原体均在感染的医学决定水平进行验证。取200l混合后标本，与常规样品一起处理，重复测定3次，记录每次检测结果；可接受标准为测定结果均呈阴性。1.4 质量控制和结果判读所有检测批次试验均需要做1个阴性和1个阳性对照，质控在控，结果才有效，否则需要重新检测。在符合质控要求的条件下进行结果判读，严格参照试剂盒说明书。1.5 统计学方法将HCMV DNA所测值转化为对数值，采用Microsoft Excel 2007统计软件，进行均值、标准差、偏倚、线性范围等相关分析。2 结果2.1 正确度评价采用湖南圣湘科技股份有限公司提供的高、中、低3个浓度水平的标准品，每个浓度水平的标准品重复10次测定，测定结果3个浓度水平标准品绝对偏差分别为-0.01、-0.02和-0.06，均log0.4，正确度验证通过。2.2 批内重复性和批间精密度评价(1)批内重复性精密度。实验室收集的低浓度和高浓度两个样本，每个浓度批内各重复测定20次，低浓度和高浓度样本批内重复性精密度CV分别为3.9%、0.11%，均5%，且测量批内重复性精密度CV3/5TEa(0.24)，均在容许范围内。(2)测量批间精密度。实验室收集的低浓度和高浓度两个样本，每个浓度批间各重复测定20次，低浓度和高浓度样本批间精密度CV分别为4.05%、0.94%，均5%，且测量批间精密度CV4/5 TEa(0.32)，均在容许范围内。2.3 线性区间评价对各浓度梯度测定结果log值做平均斜率法验证线性范围，实测浓度log均值与理论浓度线log值线性回归方程为y=0.967x0.309，拟合曲线相关系数R2=0.999，各项指标均通过，符合试剂盒说明书声称的测量线性范围4.00E024.00E09 copies/ml。线性区间验证结果见表1和图1。中国医学装备2023年8月第20卷第8期 聚合酶链反应系统检测 人巨细胞病毒DNA的性能验证及评价*-袁 方 等2.4 检出限评价将标准品稀释至浓度4.00E02 copies/ml，总计重复25次，阳性检出率为100%，符合试剂盒说明书声称的检测下线。2.5 抗干扰能力评价检测3种常见抑制物对HCMV DNA结果影响，甘油三酯6 mmol/L、总胆红素300mol/L和血红蛋白20 g/L对HCMV DNA检测无干扰，绝对偏图1 实测浓度与理论浓度线性关系示图0.042 ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI学术论著表1 线性区间验证结果 样本号重复1次重复2次重复3次log均值浓度值(copies/ml)log值浓度值(copies/ml)log值浓度值(copies/ml)log值2022014.05E099.61 3.82E099.58 3.88E099.59 9.592022023.33E088.52 3.61E088.56 3.52E088.55 8.542022033.62E077.56 3.76E077.57 3.10E077.49 7.542022043.16E066.50 3.08E066.49 3.11E066.49 6.492022053.72E055.57 3.76E055.58 3.64E055.56 5.572022062.48E044.39 2.34E044.37 2.56E044.41 4.392022072.53E033.40 2.91E033.46 2.42E033.38 3.422022082.33E022.37 1.94E022.29 2.27E022.36 2.34差log0.4，符合试剂说明书要求。测定结果统计见表2。2.6 交叉反应评价将l与HCMV DNA(200l)具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体(乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人类疱疹病毒4型、人乳头瘤病毒6/11型)样本加入200 l经确认的阴性样本中充分混匀，与常规样品一起处理测定，重复测定3次，结果均为阴性，交叉反应均通过，测定结果统计见表3。表2 抗干扰能力验证结果抑制物干扰结果对照测定偏差值浓度均值(copies/ml)log值浓度均值(copies/ml)log值log值甘油三酯(6 mmol/L)1.23E044.091.37E044.14-0.05总胆红素(300mol/L)1.23E044.091.37E044.14-0.05血红蛋白(20 g/L)1.35E044.131.37E044.14-0.01注：表中为绝对值。表3 交叉反应验证测定结果样本号真实成分重复1次重复2次重复3次202209乙肝病毒阴性阴性阴性202210丙肝病毒阴性阴性阴性202211单纯疱疹病毒阴性阴性阴性202212人类疱疹病毒4型阴性阴性阴性202213人乳头瘤病毒6/11型阴性阴性阴性3 讨论HCMV能够引起广泛持续的感染，整个生命周期可以分为产毒性感染，潜伏感染和再激活感染3个时期。免疫力正常人群感染后一般呈隐性感染，但可终生携带病毒，一旦机体免疫力降低，可再次激活17。目前，医院移植患者较多，该患者由于长期服用免疫抑制药物导致免疫状态低下，体内潜伏的HCMV容易再活化形成HCMV感染，进一步发展为HCMV病，可对移植患者造成一系列直接和间接伤害，如发热、炎症、排斥等18。因此，真实可靠的HCMV检测结果显得尤为重要，不仅是预防感染HCMV的关键，也是监测患者治疗效果的重要指标。检测系统的性能验证是检验工作中保证检测质量的前提，能如实反映实验室检测水平，根据要求只有符合实验室预期的检测系统才能应用于检测。本研究根据卫生行业标准和CANS-GL039:2019分子诊断检验程序性能验证指南10要求，尽可能选取比较全面的方案进行该试剂与其配套设备组成的检测系统进行性能验证，通过客观数据来证实实验结果准确可靠，满足临床需要求。本研究实验数据显示，正确度验证符合厂家声明，正确度验证通过。本研究在进行正确度验证时采用参比方法，样本分别选用高、中、低3个浓度的厂家标准物质，此方法通常为诊断的“金标准”、行业公认方法、能满足临床预期用途的方法9。精密度是在规定的条件下，对同一检测对象多次重复测定所得到结果的一致程度，表示测量结果的再现性，是获得良好准确性的先决条件19。该研究实验结果显示批内CV分别为3.90%和0.11%，批间CV分别为4.05%和0.94%，均5%，表明该试剂盒性能稳定，重复性好。线性评价选用4.00E09 copies/m的临床样本倍比稀释后得到涵盖线性范围内的8个浓度，将实际测量值与理论测量值多项回归分析，验证结果为一阶方程式，表明线性关系良好。检测下线的验证对中国医学装备2023年8月第20卷第8期 聚合酶链反应系统检测 人巨细胞病毒DNA的性能验证及评价*-袁 方 等学术论著ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI 43PCR检测非常重要，反应该试剂盒灵敏性、能够检测到HCMV DNA最小值，代表该试剂盒检测能力，本研究最低检出限为4.00E02 copies/ml，重复25次测定，检出率为100%，表明系统灵敏度已经达到生产厂家的检测要求，实验室具备系统所要求的检测能力。本研究通过抗干扰能力验证，临床样本中一定浓度的甘油三酯、总胆红素和血红蛋白对实验的干扰在一定程度上是可以接受的，该实验室抗干扰能力通过。交叉反应需验证检测对象为可能存在交叉反应的病原体对检测的影响，这类病原体主要是与HCMV DNA具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体，并且需要在病原体感染的医学决定水平进行验证。本研究在临床已确定的HCMV DNA样本中混入乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒6/11型，与常规样本一起处理和检测，检测结果可接受，交叉反应均通过。4 结论核酸检测是HCMV感染诊断的重要方法。本研究结果显示，HCMV DNA实时荧光定量PCR检测系统的结果准确可靠，精密度好，灵敏度高，线性范围广，抗干扰能力强，无相同病原体的交叉反应现象，与试剂盒说明书提供的性能一致，可以满足临床检测需要。参考文献 123456江龙凤,金艳,柳燕.人巨细胞病毒IE抗原快速免疫荧光检测法在先天性人巨细胞病毒感染筛查中的应用J.中华诊断学电子杂志,2019,7(4):259-264.Poole E,Neves T,COliveira M,et al.Human Cytomegalovirus Interleukin 10 Homologs:Facing the Immune SystemJ.Front Cell Infect Microbiol,2020,10:245.Zhang XY,Fang F.Congenital human cytomegalovirus infection and neurologic diseases in newbornsJ.Chin Med J(Engl),2019,132(17):2109-2118.Einsele H,Ljungman P,Boeckh M.How I treat CMV reactivation after allogeneic hematopoietic stem cell transplantationJ.Blood,2020,135(19):1619-1629.Sezgin E,An P,Winkler CA.Host Genetics of 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