颈动脉粥样硬化斑块患者外周血LCAT基因启动子区DNA甲基化情况观察.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 24 期颈动脉粥样硬化斑块患者外周血LCAT基因启动子区DNA甲基化情况观察赵佳1，姜小建1，谢紫阳1，屈晓艳2，左林21 西安市中心医院检验科，西安 710003；2 空军军医大学唐都医院放射科摘要：目的观察颈动脉粥样硬化斑块患者外周血卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）基因启动子区DNA甲基化情况。方法颈动脉粥样硬化斑块患者52例（观察组），同期无颈动脉粥样硬化斑块健康体检者50例（对照组），对所有受试者进行LCAT基因启动子区DNA甲基化检测，比较两组甲基化占比；对观察组患者进行头颈部CT血管成像（CTA）检查，比较观察组甲基化患者和非甲基化患者血管狭窄情况。结果观察组外周血LCAT基因启动子区DNA甲基化占比为65.38%（34/52），对照组外周血LCAT基因启动子区DNA甲基化占比为36.00%（18/50），两组甲基化占比比较，P0.05。观察组34例甲基化患者中，颈动脉轻中度狭窄21例、重度及闭塞13例；观察组18例非甲基化患者中，颈动脉轻中度狭窄16例、重度及闭塞2例；观察组甲基化患者与非甲基化患者颈动脉狭窄严重程度比较，P均0.05。结论颈动脉粥样硬化斑块患者外周血LCAT基因启动子区DNA甲基化占比高，LCAT基因启动子区DNA甲基化与动脉粥样硬化斑块的密切相关。关键词：动脉粥样硬化；卵磷脂胆固醇酰基转移酶；DNA甲基化；颈动脉狭窄程度doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.24.005 中图分类号：R543.5 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）24-0021-04DNA methylation in the promoter region of LCAT gene in peripheral blood of patients with carotid atherosclerotic plaqueZHAO Jia1，JIANG Xiaojian，XIE Ziyang，QU Xiaoyan，ZUO Lin1 Department of Laboratory，Xian Central Hospital，Xian 710003，ChinaAbstract：Objective To observe the DNA methylation in the promoter region of the lecithin cholesterol acyltransferase（LCAT）gene in peripheral blood of patients with carotid atherosclerotic plaque.Methods Fifty-two patients with carotid atherosclerotic plaque（observation group）and 50 healthy subjects without carotid atherosclerotic plaque（control group）during the same period were selected.DNA methylation in the promoter region of the LCAT gene was detected in all subjects to compare the difference of the methylation rate between the two groups.Head and neck CT angiography（CTA）examination was performed in the observation group.The degree of vascular stenosis was compared between methylated patients and non-methylated patients in the observation group.Results The DNA methylation rate in the promoter region of the LCAT gene in peripheral blood of the observation group was 65.38%（34/52），while that of the control group was 36.00%（18/50），with significant difference in the methylation rate between the two groups（P0.05）.Among the 34 methylated patients in the observation group，21 cases had mild-to-moderate carotid artery stenosis and 13 cases had severe stenosis or occlusion.Among the 18 non-methylated patients in the observation group，16 cases had mild-to-moderate carotid artery stenosis and 2 cases had severe stenosis or occlusion.There were significant differences in the severity of carotid artery stenosis between methylated and non-methylated patients in the observation group（P0.05）.Conclusion The DNA methylation rate in the promoter region of the LCAT gene in peripheral blood of patients with carotid atherosclerotic plaque is higher，and the DNA methylation in the promoter region of the LCAT gene is closely related to the formation of atherosclerotic plaque.Key words：atherosclerosis；lecithin cholesterol acyltransferase；DNA methylation；the degree of carotid artery stenosis基金项目：西安市科技计划项目 201805102YX10SF36（6），22YXYJ0088。第一作者简介：赵佳（1984-），女，博士，主任检验师，主要研究方向为临床免疫与分子生物学检验。E-mail：通信作者简介：左林（1984-），男，硕士，副主任医师，主要研究方向为临床影像诊断与病理基础。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）21山东医药2023 年第 63 卷第 24 期由动脉粥样硬化所导致的心脑血管疾病已成为当今严重危害人类生命健康的疾病之一。颈动脉粥样硬化斑块是一种常见的动脉粥样硬化表现形式，其临床特点是颈动脉内膜下脂质沉积和纤维组织增生，导致血管腔狭窄和血流受限。脂代谢异常是其重要发病机制。卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）催化血浆脂蛋白中游离胆固醇的酯化，在高密度脂蛋白（HDL）代谢和胆固醇的逆向转运过程中发挥关键作用1-2。LCAT异常可影响胆固醇的逆向转运，进而促进动脉粥样硬化的发生和发展3。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，甲基化通常发生在基因启动子区，抑制基因转录，这种变化可以通过细胞分化遗传。研究4显示，动脉粥样硬化患者可以通过DNA甲基化调控脂代谢相关基因的表达，影响其功能，与动脉粥样硬化的形成密切相关。本研究观察了颈动脉粥样硬化斑块患者外周血LCAT基因启动子区DNA甲基化情况，并分析甲基化占比与颈动脉狭窄程度的关系，以期为动脉粥样硬化的发病机制和临床治疗提供新的理论和实验依据。1 资料与方法 1.1临床资料选取2020年612月西安市中心医院收治的颈动脉粥样硬化斑块患者52例（观察组），男33例，女 19例；年龄 5064（57.06 4.42）岁；BMI（25.10 3.46）kg/m2；TC（4.42 0.97）mmol/L；TG（1.76 0.75）mmol/L；HDL-C（1.07 0.23）mmol/L；LDL-C（2.62 0.89）mmol/L；SBP（134.65 20.86）mmHg；DBP（80.24 12.79）mmHg；FBG（6.11 2.13）mmol/L；有吸烟史 19 例（36.54%）。纳入标准：符合 中国头颈部动脉粥样硬化诊治共识 的诊断标准5；年龄65岁；受试对象知情同意并表示愿意配合。排除标准：严重感染性疾病；恶性肿瘤；血液和免疫系统疾病；严重肝肾功能不全；颅内出血和占位性病变；近期服用降血脂类药物。另选同期无颈动脉粥样硬化斑块健康体检者50例（对照组），男30例，女20例；年龄5062（55.64 4.26）岁；BMI（23.76 3.73）kg/m2；TC（4.15 0.88）mmol/L；TG（1.44 0.54）mmol/L；HDL-C（1.16 0.30）mmol/L；LDL-C（2.37 0.76）mmol/L；SBP（131.52 18.34）mmHg；DBP（78.46 11.32）mmHg；FBG（5.75 1.94）mmol/L；有吸烟史11例（22.00%）。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。本研究经医院伦理委员会通过，且患者知情同意。1.2外周血LCAT基因启动子区DNA甲基化情况观察采集所有受试者空腹肘静脉血2 mL，应用血液基因组DNA抽提试剂盒提取外周血基因组DNA，严格按照说明书进行操作。提取的DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，并检测其浓度和纯度。-80 冰箱保存备用。在 NCBI GenBank 数据库中查询 LCAT（GenBank ID：3931）基因序列，应用 MethPrimer 甲基化预测软件（http：/www.urogene.org/methprimer/）对LCAT基因启动子区进行甲基化预测。经预测存在3个甲基化区域，分别设计3对引物，引物序列：区域1，上游引物GAGGGTTATAGATTGGTGGTTAGT，下 游 引 物 CAAAAACATAAACATACCACCATC；区域 2，上游引物 AGTTGGGTTTTTAYGGTTAATTTTG，下游引物CACCTTACCTCCRAAAAATAAACAC；区域 3，上游引物 ATGGTTTATGGYGATTTGTGATT，下 游 引 物CTCACTATTCCTAAATAAACCAAACA。以提取的外周血基因组DNA作为模板，进行PCR反应，扩增3个甲基化区域基因片段。PCR反应条件为：95 预变性35 min；94 变性 30 s；5560 退火 2530 s；72 延伸3050 s，35个循环。反应后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因，与pUCm-T Vector连接，连接产物转化感受态细胞（SK9307），进行蓝白斑筛选，提取质粒，应用硫化测序 PCR（BSP）方法对甲基化位点进行测序。DNA甲基化判定标准：用亚硫酸氢盐处理DNA，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不会转变。随后在PCR扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，然后对PCR产物进行测序，再与DNA原始序列比对来判定CpG位点是否发生甲基化。1.3颈动脉狭窄程度检查对观察组进行头颈部CTA检查，根据 中国头颈部动脉粥样硬化诊治共识 对血管进行狭窄程度进行判定，轻中度狭窄为血管狭窄程度70%及血管闭塞5。1.4统计学方法采用SPSS23.0统计软件。计数资料比较采用 2检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果 观察组外周血LCAT基因启动子区DNA甲基化占比为 65.38%（34/52），对照组外周血 LCAT 基因启动子区DNA甲基化占比为36.00%（18/50），两组甲基化占比比较，P0.05。观察组34例甲基化患者中，颈动脉轻中度狭窄21例（61.8%）、重度及闭塞13例（38.2%）；观察组18例非甲基化患者中，颈动脉轻中度狭窄 16 例（88.9%）、重度及闭塞 2 例（11.1%）；两者轻中度狭窄、重度及闭塞占比比较，P22山东医药2023 年第 63 卷第 24 期均0.05。观察组甲基化患者和非甲基化患者典型病例CTA图像见图1。3 讨论 颈动脉粥样硬化斑块是一种动脉粥样硬化病变，通常呈现为黄色或黄棕色斑块，质地较硬，贴附在颈动脉内膜下，形成脂质斑块和纤维斑块，它主要由胆固醇、脂质和钙盐组成，随着时间的推移，这些斑块会逐渐增厚并脱落6。颈动脉粥样硬化斑块的形成和发展会引起局部血流动力学的改变。斑块的存在会使得颈动脉内膜变得不规则，增加了血流阻力。同时斑块的脱落可能会导致血栓形成，进一步阻塞血流7。颈动脉粥样硬化斑块的存在增加了脑卒中和心脏病等心血管事件的风险8。颈动脉粥样硬化斑块的临床表现可以因患者的个体差异而有所不同，但一般包括以下几个方面：首先，颈动脉听诊时可能会发现异常的血流声音，如血流湍流声、颈动脉杂音等。这些异常声音可能是由于颈动脉粥样硬化斑块引起的血流不畅所致9。其次，颈动脉粥样硬化斑块的存在会导致颈动脉血流减少甚至完全中断，使得颈动脉搏动减弱或消失。医生可以通过触摸颈动脉来评估患者的颈动脉搏动情况10。此外，颈动脉粥样硬化斑块可能导致脑供血不足，引起一系列脑血管症状，如头晕、头痛、视力模糊、言语困难、肢体无力等，严重的情况下，还可能出现突发性面瘫、短暂性偏瘫等症状。最后，颈动脉粥样硬化斑块的并发症还可能包括心血管症状，如胸痛、心悸、呼吸困难等。这是由于斑块脱落导致血流阻塞心脏供血的冠状动脉所致。LCAT基因位于人类染色体16q22.1上，包含6个外显子和5个内含子，全长约为4 200 bp，编码胆固醇逆向转运过程中的关键酶 LCAT。LCAT 在体内的主要功能是催化游离胆固醇与磷脂结合，形成胆固醇酯。这个过程在胆固醇代谢中起着重要作用，对于维持胆固醇平衡至关重要。LCAT基因的甲基化是指DNA中的甲基化修饰发生在LCAT基因上。甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式，不涉及DNA序列的变化11。这种修饰是通过DNA甲基转移酶将甲基基团转移到DNA分子上的胞嘧啶碱基上实现的。在LCAT基因上，甲基化通常发生在CpG位点上，这是DNA序列中的一种特殊序列，其中的C碱基与紧邻的G碱基通过磷酸二酯键连接。CpG位点的甲基化状态可以影响基因的表达，从而影响相关的生物过程和疾病的发生12。研究13-14发现，DNA异常甲基化在炎症反应、内皮损伤、泡沫细胞形成和平滑肌细胞增殖等过程中起着重要作用。此外，脂代谢相关基因的DNA甲基化在动脉粥样硬化的发生和发展过程中也发挥了一定的调控作用15-16。然而，LCAT基因的甲基化与动脉粥样硬化之间的关系尚不明确。本研究显示，观察组 LCAT基因启动子区DNA甲基化占比高于对照组，此结果与陈久凯等17的研究结果一致。本研究还发现，观察组甲基化者颈动脉狭窄程度明显高于非甲基化者。结果表明，LCAT基因甲基化可能影响胆固醇代谢和胆固醇平衡的维持，与动脉粥样硬化的发生和发展密切相关。考虑到动脉粥样硬化的发生和发展与脂代谢紊乱密切相关，LCAT基因的甲基化可能是动脉粥样硬化发生的一个重要机制。近年来，许多学者采用颈动脉超声检查评估颈动脉狭窄情况18。颈动脉血管超声诊断具有成本较低、简单无创的特点，不仅可以动态检测血流动力学情况，还能评估血管内膜损伤情况。然而受颅骨的影响，超声无法全面评估颈内动脉全段及颅内血管的狭窄情况，存在一定的局限性19。因此，本研究采用256排CT血管成像评估动脉粥样硬化患者头颈部血管狭窄程度，不受颅骨的干扰，能够准确、全面地显示颈内动脉、颈外动脉、颈总动脉及椎动脉全段异常部位的狭窄程度和斑块形态，从而使结果更加准确、全面。总之，动脉粥样硬化患者外周血LCAT基因启动子区DNA甲基化与动脉粥样硬化斑块的形成密切相关，可能是促进动脉粥样硬化的发生和发展重要影响因素。至于LCAT基因甲基化是否通过影响LCAT的生物学功能而导致脂代谢紊乱，我们将在后续研究中进一步探讨。需要注意的是，LCAT基注：A（血管三维重建）和B（血管曲面重建）：观察组甲基化患者，女，61岁，无明显诱因出现右侧肢体活动障碍1 d，CTA图像提示左侧颈内动脉全段闭塞；C（血管曲面重建）：观察组非甲基化患者，男，58岁，以头痛2周前来就诊，右侧颈内动脉颈段、破裂孔段及虹吸段多发钙化斑块形成，管腔轻中度狭窄。图1观察组甲基化患者和非甲基化患者典型病例CTA图像23山东医药2023 年第 63 卷第 24 期因与动脉粥样硬化以及动脉狭窄的关系是复杂的，受到多种遗传和环境因素的影响。因此，在临床实践中，应综合考虑多个因素，包括基因、生活方式、环境等，来评估患者的动脉粥样硬化风险和狭窄程度。参考文献：1彭琴，周琴怡，黄柯，等.早发冠心病相关脂质代谢基因变异的研究进展 J.中国动脉硬化杂志，2021，29（3）：264-270.2OUIMET M，BARRETT T J，FISHER E A.HDL and reverse cholesterol transport：basic mechanisms and their roles in vascular health and disease J.Circ Res，2019，124（10）：1505-1518.3赵佳，左林，姜小建，等.动脉粥样硬化患者高同型半胱氨酸血症与胆固醇逆向转运的关系 J.现代检验医学杂志，2019，34（6）：47-49.4LEE H T，OH S，RO D H，et al.The key role of DNA methylation and histone acetylation in epigenetics of atherosclerosis J.J Lipid Atheroscler，2020，9（3）：419-434.5周华东，王延江，张猛.中国头颈部动脉粥样硬化诊治共识J.中华神经科杂志，2017，50（8）：572-578.6ABBOTT A L，PARASKEVAS K I，KAKKOS S K，et al.Systematic review of guidelines for the management of asymptomatic and symptomatic carotid stenosisJ.Stroke，2015，46（11）：3288-3301.7DASAGRANDHI D，MUTHUSWAMY A，SWAMINATHAN J K.Atherosclerosis：nexus of vascular dynamics and cellular cross talks J.Mol Cell Biochem，2022，477（2）：571-584.8JEBARI-BENSLAIMAN S，GALICIA-GARCA U，LARREA-SEBAL A，et al.Pathophysiology of atherosclerosisJ.Int J Mol Sci，2022，23（6）：3346.9RICH K.Carotid bruit：a review J.J Vasc Nurs，2015，33（1）：26-27.10OJIMA S，KUBOZONO T，KAWASOE S，et al.Gender differences in the risk factors associated with atherosclerosis by carotid intima-media 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