蠲痹汤基准样品“一测多药”薄层鉴别方法研究.pdf

Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med蠲痹汤基准样品“一测多药”薄层鉴别方法研究高永坚，汤春花a，林碧珊，陈锦霞，梁凤友*，曾杉*国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528305摘要 目的：建立“一测多药”薄层鉴别方法，同时鉴别蠲痹汤基准样品中的当归、川芎、羌活和独活 4 个药味。方法：通过考察供试品溶液制备方法、展开剂、点样量、点样方式、加热时间等因素，建立最优的薄层鉴别方法，并进行专属性和耐用性考察。结果：建立了“一测多药”薄层鉴别方法，即吸取供试品溶液 35 L、对照品溶液和对照药材溶液各 2 L，分别点于同一硅胶 GF254薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5.01.0 2.00.2）为展开剂，置紫外光灯（254 nm）下检视，供试品在与藁本内酯对照品色谱相应的位置上显相同深蓝色斑点，再喷以 10%硫酸乙醇溶液，在 105 加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品在与羌活醇对照品和独活对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。结论：所建立的薄层鉴别方法专属性强、耐用性好，提高检测效率的同时降低了检测成本。关键词 蠲痹汤；一测多药；薄层鉴别；质量控制中图分类号 R282.5 文献标识码 A 文章编号 1673-4890（2023）08-1776-06 doi：10.13313/j.issn.16734890.20221219001A Thin Layer Chromatography Based“One-test with Multi-drugs”Identification Method for Benchmark Material of Juanbi DecoctionGAO Yong-jian,TANG Chun-huaa,LIN Bi-shan,CHEN Jin-xia,LIANG Feng-you*,ZENG Shan*Sinopharm Group Guangdong Medi-word Pharmaceutical Co.,Ltd.,Foshan 528305,ChinaAbstract Objective:To establish a thin layer chromatography(TLC)based one-test with multi-drugs method for identifying Angelicae Sinensis Radix,Chuanxiong Rhizome,Notopterygh Rhizoma et Radix,and Angelicae Pubescentis Radix in the benchmark material of Juanbi Decoction.Methods:The TLC conditions including the preparation method of the test solution,developing solvent,spotting volume,spotting method,and heating time were optimized,and the specificity and durability of the established method were examined.Results:The TLC based one-test with multi-drugs method conditions:3-5 L test solution,2 L control solutions,and 2 L control herb solution were spotted onto the same silica gel GF254 thin layer plate and developed with cyclohexane-dichloromethane-ethyl acetate-formic acid(5.0:1.0:2.0:0.2).The plate was then examined under UV light(254 nm).The spot of the test solution appeared same color(dark blue)at the corresponding position of ligustilide(control).Subsequently,the plate was sprayed with 10%ethanol sulfate solution,heated at 105 until the spots showed clear color,and then examined under UV light(365 nm).The fluorescent spot of the test solution appeared the same color at the corresponding position of notopterol(control)and Angelicae Pubescentis Radix(control).Conclusion:This TLC method was highly specific and durable,with improved detection efficiency and reduced detection costs.Keywords Juanbi Decoction;one-test with multi-drugs;thin-layer chromatography-based identification;quality control蠲痹汤出自清代程国彭1医学心悟，原文记载“通治风、寒、湿三气，合而成痹。羌活（行上力大）、独活（行下力专，各一钱）、桂心（五分）、秦艽（一钱）、当归（三钱）、川芎（治风先治血，七分）、甘草（炙，五分）、海风藤（二钱）、桑枝（三钱）、乳香（透明者）、木香（止痛须理气，各八 中药工业 基金项目 工信部产业技术基础公共服务平台项目（2022-230-221）*通信作者 梁凤友，工程师，研究方向：经典名方；Tel：0757-28387061，E-mail：曾杉，副主任药师，研究方向：经典名方；Tel：0757-28388531，E-mail：a 并列第一作者1776Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med分）水煎服”。该方主治卒中身体烦痛、项背拘急、手足冷痹等2，临床广泛用于治疗类风湿性关节炎、痛风性骨关节炎、膝骨关节炎等骨伤科疾病3-8。薄层鉴别是控制中药质量的重要分析手段。检索中华人民共和国药典（以下简称 中国药典）2020年版（一部）9可知，成方制剂中收载的薄层鉴别方法多为每种药味对应1个薄层鉴别方法，1个中药复方制剂的薄层鉴别需要开发多个方法才能完成，费时、费力、费试剂，检测效率低。2020年10月，国家药品监督管理局药品审评中心发布的中药新药质量标准研究技术指导原则（试行）10鼓励建立同时鉴别多个药味的薄层色谱方法。为高效把控蠲痹汤基准样品的质量，本研究以“一测多药”为目标建立薄层鉴别方法，采用1个薄层色谱系统同时鉴别蠲痹汤基准样品中当归、川芎、羌活和独活 4个药味，降低检测成本，提高检测效率。本研究建立的方法可与指纹图谱、特征图谱及含量测定方法形成互补，为蠲痹汤中药复方制剂的开发提供参考。1材料1.1仪器与耗材ATS4型全自动点样仪、Visualizer 2型成像系统（瑞士卡玛公司）；BT25S型分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；RE-5220 型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；DZTW 型调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）。硅胶GF254薄层板（批号：20210107，青岛海洋化工厂分厂）；TLC Silica gel 60 F254薄层板（批号：HX062464，德国Merck 公 司）；硅 胶 HSGF254薄 层 板（批 号20151204，烟台市化学工业研究所）。1.2试药对照品羌活醇（批号：111820-201705，纯度：99.9%）、藁本内酯（批号：111737-201608，纯度：99.9%）、独活对照药材（批号：120940-201612）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，批号：213476，Fisher Chemical公司）；乙酸乙酯（批号：20211012）、无水乙醇（批号：20220113）、石油醚（6090，批号：20210202）、正己烷（批号：20210524）、环己烷（批号：20210825）、二氯甲烷（批号：20210714）均为分析纯，购于北京市通 广 精 细 化 工 公 司；硫 酸 分 析 纯，批 号：20201105，现代东方（北京）科技发展有限公司；甲酸（分析纯，批号：A2106152，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。1.3样品羌活、独活、肉桂、秦艽、当归、川芎、甘草、海风藤、桑枝、乳香、木香药材均购自主产区或道地产区。经广东一方制药有限公司潘礼业主任工程师 鉴 定，羌 活 为 伞 形 科 植 物 羌 活 Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang的干燥根茎和根、独活为 伞 形 科 植 物 重 齿 毛 当 归 Anglica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan 的干燥根、肉桂为樟科植物肉桂 Cinnamomum cassia Presl 的干燥树皮、秦艽为龙胆科植物秦艽 Gentiana macrophylla Pall.的干燥根、当归为伞形科植物当归 Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根、川芎为伞形科植物川芎 Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎、甘草为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎、海风藤为胡椒科植物风藤 Piper kadsura（Choisy）Ohwi 的干燥藤茎、桑枝为桑科植物桑 Morus alba L.的干燥嫩枝、乳香为橄榄科植物乳香树 Boswellia carterii Birdw.树皮渗出的树脂、木香为菊科植物木香 Aucklandia lappa Decne.的干燥根。上述 11 味药材按 中国药典 2020 年版9检验均合格。乳香饮片参照 安徽省中药饮片炮制规范 2019 年版11炮制，其他饮片按 中国药典 2020 年版9炮制。本方 11 味药材的产地信息见表1。表1蠲痹汤11味药材的产地信息羌活四川省理县四川省小金县四川省北川县四川省平武县QH201、QH202QH203、QH204、QH205、QH216、QH217、QH218、QH219、QH220QH206、QH207、QH208QH209、QH210药材产地批号1777Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med独活肉桂秦艽当归川芎甘草海风藤桑枝乳香木香重庆市巫溪县四川省北川县四川省平武县甘肃省华亭市甘肃省平亭市湖北省五峰县重庆市巫溪县广东省肇庆市广西壮族自治区玉林市广东省云浮市云南省玉龙县云南省兰坪县云南省维西县甘肃省渭源县甘肃省漳县甘肃省陇南市甘肃省宕昌县青海省互助县甘肃省陇西县甘肃省礼县甘肃省岷县四川省彭州市四川省眉山市四川省什邡市甘肃省陇西县甘肃省民勤县四川省宁南县内蒙古自治区喀喇沁旗宁夏回族自治区银川市云南省金平县湖南省龙山县湖北省来凤县湖北省咸丰县四川省宁南县云南省陆良县云南省麒麟县广西壮族自治区玉林市广东省广州市安徽省亳州市云南省丽江市云南省玉龙县四川省天全县四川省芦山县四川省宝兴县湖北省恩施市DH201、DH202、DH203、DH204、DH205DH208DH209DH211DH215DH301DH210、DH306、DH307、DH401、DH402RG01、RG02、RG03、RG04、RG05RG226、RG227、RG228、RG229、RG230RG251、RG252、RG253、RG254、RG255QJ201、QJ205、QJ215、QJ218、QJ220QJ221、QJ222、QJ223、QJ224、QJ225QJ226、QJ227、QJ228、QJ229、QJ230DG01DG02DG07DG09DG13、DG227DG220DG223DG217、DG04、DG301、DG302、DG304、DG305CX01、CX05、CX301、CX302、CX303、CX304、CX306、CX307、CX308CX07、CX09、CX10、CX222、CX225CX11GC01、GC02、GC05GC06GC16GC19、GC20、GC21、GC22、GC23GC313、GC314、GC315、GC316、GC317HFT201、HFT202、HFT203、HFT204、HFT205HFT211、HFT212、HFT213、HFT214、HFT215HFT216、HFT217、HFT218HFT219、HFT220SZ201、SZ202、SZ203、SZ204、SZ205SZ206、SZ207、SZ208、SZ209、SZ210SZ211、SZ212、SZ213、SZ214、SZ215RX201、RX202、RX203、RX204、RX205RX206、RX207、RX208、RX209、RX210RX211、RX212、RX213、RX214、RX215MX201、MX202MX301、MX304、MX305MX206MX207MX208、MX209、MX210MX211、MX212、MX213、MX214、MX215续表1药材产地批号1778Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med2方法2.1蠲痹汤基准样品制备方法取羌活 3.73 g、独活 3.73 g、肉桂 1.87 g、秦艽 3.73 g、当归 11.19 g、川芎 2.61 g、蜜炙甘草1.87 g、海风藤7.46 g、桑枝11.19 g、乳香2.98 g、木香2.98 g混合，加水400 mL，浸泡30 min，武火煮沸后，文火微沸煎煮 30 min，350目筛网趁热滤过，滤液冷冻干燥得蠲痹汤基准样品。15批蠲痹汤基准样品组方药材信息见表2。2.2供试品溶液的制备取基准样品2 g，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL溶解，加石油醚（6090）振摇提取2次，每次20 mL，合并石油醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯2 mL溶解，即得。2.3对照药材溶液制备取独活对照药材0.2 g，加甲醇5 mL，超声15 min，滤过，取滤液，即得。2.4对照品溶液制备取藁本内酯对照品、羌活醇对照品，加甲醇制成质量浓度分别为1.0、0.3 mg mL1的溶液，即得。2.5阴性对照溶液制备分别取缺少当归、川芎和缺少独活的基准样品各2 g，按照2.2项下的方法制备阴性对照溶液。2.6显色剂的配制取硫酸5.7 mL，缓缓注入适量无水乙醇中，冷却至室温，再用无水乙醇稀释至100 mL，摇匀，即得。2.7“一测多药”鉴别方法参照薄层色谱法（中国药典 2020年版9通则 0502）试验，吸取供试品溶液 35 L、对照药材溶液和对照品溶液各 2 L，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5.01.02.00.2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与藁本内酯对照品色谱相应的位置上显相同深蓝色斑点；再喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与羌活醇对照品和独活对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。2.8方法学考察2.8.1专属性考察吸取对照品溶液与对照药材溶液各2 L，阴性溶液、供试品（批号：JB211108-1）溶液各3 L，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，按2.7项下方法鉴别。结果表明，供试品在与对照品和对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照色谱中均未出现干扰斑点，说明该方法可以对当归、川芎、羌活和独活专属鉴别。2.8.2耐用性考察2.8.2.1薄层板的考察吸取对照品溶液与对照表215 批蠲痹汤基准样品组方药材信息样品批号JB211108-1JB211108-2JB211108-3JB211109-4JB211109-5JB211109-6JB211111-7JB211111-8JB211111-9JB211125-10JB211125-11JB211125-12JB211115-13JB211115-14JB211115-15药材批号QH201、DH201、RG01、QJ201、DG01、CX01、GC01、HFT201、SZ201、RX201、MX201QH202、DH202、RG02、QJ205、DG02、CX05、GC02、HFT202、SZ202、RX202、MX202QH203、DH203、RG03、QJ215、DG04、CX07、GC05、HFT203、SZ203、RX203、MX301QH204、DH204、RG04、QJ218、DG07、CX09、GC06、HFT204、SZ204、RX204、MX304QH20、DH205、RG05、QJ220、DG09、CX10、GC16、HFT205、SZ205、RX205、MX305QH206、DH208、RG226、QJ221、DG13、CX11、GC19、HFT211、SZ206、RX206、MX206QH207、DH209、RG227、QJ222、DG217、CX222、GC20、HFT212、SZ207、RX207、MX207QH208、DH211、RG228、QJ223、DG220、CX225、GC21、HFT213、SZ208、RX208、MX208QH209、DH215、RG229、QJ224、DG223、CX301、GC22、HFT214、SZ209、RX209、MX209QH210、DH21、0RG230、QJ225、DG227、CX302、GC23、HFT215、SZ210、RX210、MX210QH216、DH301、RG251、QJ226、DG301、CX303、GC313、HFT216、SZ211、RX211、MX211QH217、DH306、RG252、QJ227、DG302、CX304、GC314、HFT217、SZ212、RX212、MX212QH218、DH307、RG253、QJ228、DG304、CX306、GC315、HFT218、SZ213、RX213、MX213QH219、DH401、RG254、QJ229、DG305、CX307、GC316、HFT219、SZ214、RX214、MX214QH220、DH402、RG255、QJ230、DG306、CX308、GC317、HFT220、SZ215、RX215、MX2151779Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med药 材溶液各 2 L，阴性溶液、供试品（批号：JB211108-1）溶液各 3 L，分别点于 3 个品牌的GF254薄层板上，按2.7项下的方法鉴别，结果显示，3个品牌的薄层板对鉴别影响不大，后续研究选用德国Merck公司TLC Silica gel 60 F254薄层板。2.8.2.2温度的考察吸取对照品溶液与对照药材溶液各2 L，阴性溶液、供试品（批号：JB211108-1）溶液各3 L，按2.7项下方法，分别在不同的温度环境（低温4、常温24、高温40）进行鉴别，结果表明，不同温度下供试品斑点检视效果差异不大。2.8.2.3相对湿度的考察吸取对照品溶液与对照药材溶液各 2 L，阴性溶液、供试品（批号：JB211108-1）溶液各 3 L，按 2.7项下方法，分别在不同相对湿度（25%、50%、75%）环境下进行鉴别，结果表明，不同相对湿度对检视效果基本无影响。315批基准样品的鉴别按照2.7项下的方法，对15批蠲痹汤基准样品中当归、川芎、羌活、独活进行鉴别，结果见图1。15批供试品在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，均显示相同颜色的斑点。表明该方法耐用性较好，可以进行专属鉴别。4讨论医学心悟中记载蠲痹汤剂量为“羌活、独活各一钱，桂心五分，秦艽一钱，当归三钱，川芎七分，甘草五分，海风藤二钱，桑枝三钱，乳香、木香各八分”1，根据经典名方开发指引12可知，本方剂量按照一钱约等于3.73 g折算，照此折算后各药剂量在 中国药典2020年版9的指导剂量范围内。关于煎服方法，原方仅载“水煎服”，其余医籍中均未记载该方的制法和服法，或同医学心悟一致，仅言“水煎服”，故本方采用原方记载“水煎服”。按照按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）13的相关要求，本方参照医疗机构中药煎药室管理规范14进行煎煮。关于鉴别方法的选择，中国药典中药质量标准研究制定技术要求15强调薄层色谱可将中药内含成分通过分离达到直观、可视化，具有承载信息大、专属性强、快速、经济、操作简便等优点，可作为中药鉴别的首选方法。基于此，本研究用1 个薄层系统同时鉴别蠲痹汤物质基准中的当归、川芎、羌活和独活4种药味，专属性强、耐用性好，提高了检测效率。在薄层鉴别方法开发的过程中，分别考察了供试品溶液制备方法、展开剂、点样量、点样方式及加热时间等因素的影响，结果表明，按2.2项下方注：1.藁本内酯对照品溶液；2.羌活醇对照品溶液；3.独活对照药材溶液；4.供试品溶液（JB211108-1）；5.供试品溶液（JB211108-2）；6.供试品溶液（JB211108-3）；7.供试品溶液（JB211109-4）；8.供试品溶液（JB211109-5）；9.供试品溶液（JB211109-6）；10.供试品溶液（JB211111-7）；11.供试品溶液（JB211111-8）;12.供试品溶液（JB211111-9）；13.供试品溶液（JB211125-10）；14.供试品溶液（JB211125-11）；15.供试品溶液（JB211125-12）；16.供试品溶液（JB211115-13）；17.供试品溶液（JB211115-14）；18.供试品溶液（JB211115-15）。图115批蠲痹汤基准样品的薄层色谱图1780Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med法制备的供试品溶液无乳化现象，符合实验要求；展开剂为环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5.0 1.02.00.2）时，斑点更清晰，比移值（Rf）适中，且阴性无干扰；供试品溶液点样量为 35 L时，斑点颜色更清晰、适中；点样方式（点状和条带状点样）对本薄层鉴别影响不大，本研究选择8 mm条带宽度点样；当加热时间超过2 min时，供试品的斑点清晰，阴性无干扰。在薄层鉴别中，Rf是系统适用性试验的考察指标，色谱斑点的Rf最重要的影响因素是吸附剂的性质，以及展开剂的极性和溶解能力，当应用同一种吸附剂和同一种展开系统时，被测物质的Rf还受展开容器中展开剂蒸汽的饱和度、薄层板含水量、边缘效应等因素的影响，从而导致同一特征斑点Rf有一定的大小变化16。本研究主要特征斑点的Rf基本在 0.20.8。蠲痹汤基准样品经过水煎煮，其中独活的特征成分蛇床子素质量分数很低（0.05%左右），前期建立的指纹图谱无法获取其特征峰，而通过本研究建立的薄层鉴别法可实现对独活药味的有效鉴别，是指纹图谱的有效补充，且能与含量测定相互印证，检测效率高，具有很好的应用价值。参考文献1 程国彭.医学心悟 M.北京：科学技术文献出版社，1996：133.2 张春雷，李冀.蠲痹汤加减治疗风湿痹阻型类风湿关节炎的临床疗效 J.中医药学报，2022，50（2）：68-71.3 罗嗣雄，陈小芳，刘永芳，等.蠲痹汤类治疗类风湿关节炎有效性及安全性的 Meta 分析 J.实用中医内科杂志，2021，35（9）：12-15，146-148.4 杨振宇，张良.蠲痹汤直流电导入结合水针疗法治疗痛风性关节炎疗效观察 J.现代中西医结合杂志，2015，24（34）：3848-3850.5 杨涛.毫火针配合蠲痹汤治疗寒湿痹阻型膝骨关节炎的效果观察 J.内蒙古中医药，2021，40：146-147.6 陈竹.蠲痹汤治疗肩周炎的疗效观察 J.黔南民族医专学报，2016，29（1）：47，78.7 庄义昭.针刺臀痛穴为主结合中药治疗腰椎间盘突出症30例 J.河南中医，2009，29（12）：1203-1204.8 赵云霞.加味蠲痹汤辅治中风后肩手综合征对中医证候积分及神经功能的影响 J.实用中医药杂志，2020，36（11）：1444-1445.9 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部 M.北京：中国医药科技出版社，2020.10 国家药品监督管理局药品审评中心.国家药监局药审中心关于发布 中药新药用药材质量控制研究技术指导原则（试行）等 3个指导原则的通告（2020年第 31号）EB/OL.（2020-10-12）2022-12-02.https：/ f8e9e02a253f7649ec28941ac0.11 安徽省药品监督管理局.安徽省中药饮片炮制规范 M.合肥：安徽科学技术出版社，2019：186.12 陈士林，刘安.经典名方开发指引 M.北京：科学出版社，2020：650.13 国家药品监督管理局药品审评中心.国家药监局药审中心关于发布 按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）的通告（2021年第36 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