聚合草根中尿囊素的提取及其性质分析.pdf

第 7 卷第 4 期2023 年 12 月现 代 牧 业MODERN ANIMAL HUSBANDRYVol.7 No.4Dec.2023收稿日期:2023-09-16作者简介:何金环(1975),女,河南郑州人,教授,硕士。聚合草根中尿囊素的提取及其性质分析何金环1,吕 敏2,连艳鲜1(1.河南牧业经济学院 食品与生物工程学院,河南 郑州 450046;2.华南农业大学 食品学院,广东 广州 510642)摘要:以聚合草根为原料,采用超声波辅助乙醇法提取尿囊素。以尿囊素得率为考核指标,经单因素和正交优化试验得到的尿囊素提取工艺为乙醇浓度 60%、超声功率 300 W、提取温度 60,尿囊素得率为 0.85 mg/g。在 0.10.3 mg/mL 浓度范围内,尿囊素对 DPPH 自由基清除率随尿囊素浓度升高逐渐增加,当尿囊素浓度为 0.3 mg/mL时,对 DPPH 清除率达到 68%。1 mg/mL 尿囊素对金黄色葡萄球菌(抑菌直径=39 mm)和大肠杆菌(抑菌直径=22 mm)的抑菌效果突出,而 0.1 mg/mL 尿囊素几乎没有抑菌作用。关键词:聚合草;尿囊素;提取工艺中图分类号:S816.5 文献标识码:A 文章编号:2096-2975(2023)04-0032-05Extraction and characterization of allantoin in the roots of Symphytum officinale LHE Jinhuan1,LV Min2,LIAN Yanxian1(1.College of Food and bioengineering Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou Henan 450046;2.College of Food Science South China Agricultural University,Guangzhou Guangdong 510642)Abstract:Allantoin from roots of Symphytum of ficinale L was extracted by utrasonic assisted ethanol extraction process.Taking the yield of allantoin as the evaluation indicator,through single factor and orthogonal optimization experiments,the extraction process of allantoin was obtained as follows:ethanol concentration of 60%,ultrasound power of 300 W,extrac-tion temperature of 60,and the yield of allantoin reached 0.85 mg/g.In the range of 0.1 to 0.3 mg/mL,the scaven-ging rate of DPPH free radicals by allantoin gradually increased with increasing concentration of allantoin,and when the concentration of allantoin was 0.3 mg/mL,the scavenging rate reached 68%.1 mg/mL allantoin had a prominent antibac-terial effect on Staphylococcus aureus(antibacterial diameter=39 mm)and Escherichia coli(antibacterial diameter=22 mm),while 0.1 mg/mL allantoin had almost no antibacterial effect.Key words:Symphytum officinale L;allantoin;extraction process 尿囊素(allantoin,C4H6O3N4)是嘌呤降解的中间产物,是植物体内氮素存储和转运的重要载体1,2。尿囊素具有促使组织细胞快速生长、利于组织修复、软化角质蛋白、抑制胶原酶活性和提高23何金环,等:聚合草根中尿囊素的提取及其性质分析ATP 酶活性等功效3,4。聚合草(Symphytum offici-nale L.),又称爱国草、俄罗斯紫菜等,紫草科聚合草属,多年生草本植物。聚合草叶片肥厚,茎叶鲜嫩多汁,肉质块状根,富含尿囊素。聚合草可促进动物消化道细胞增殖,从而改善胃肠道消化吸收功能,是一种饲用价值比较高的牧草5,6。本试验进行聚合草根尿囊素提取工艺的优化及尿囊素生物活性测定,旨在完善植物来源尿囊素的制备方法。1 材料与方法1.1 材料来源三年生聚合草根取自黄河滩区郑州段牧草基地试验田,洗净晾干,切片,80 烘干至恒重,粉碎过 100 目筛,封存备用。1.2 指示菌株及培养基 指示菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus au-reus)和大肠杆菌(Escherichia coli)均来自河南牧业经济学院微生物实验室。LB 培养基制备。称取胰蛋白胨 20 g、酵母浸粉5 g、氯化钠 10 g、琼脂粉 20 g,去离子水定容至 1 L,121 高压灭菌 20 min 后放置备用。1.3 尿囊素标准曲线绘制称取尿囊素标准品,蒸馏水水浴加热配制成1mg/mL 的标准液,并依次稀释为 0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL 的尿囊素标准溶液。225 nm 处光吸收值(X)与相应尿囊素浓度(Y)进行线性回归,得方程 Y=4.2967X-0.0287,R2=0.9975。1.4 尿囊素提取工艺优化准确称量聚合草根粉 2 g 置于 50 mL 烧杯中,乙醇溶解,超声波振摇,4000 g 离心 10 min,取上清。利用回归方程算出尿囊素的浓度,并按照式 1 计算尿囊素得率。通过单因素和正交优化试验测定乙醇浓度、料液比、超声功率、提取温度、提取时间对尿囊素得率的影响,确立聚合草根尿囊素提取的最佳工艺条件。尿囊素得率=CVm式 1C 为提取溶液中尿囊素浓度,mg/mL;V 为测定时加入溶液的体积,mL;m 为聚合草根粉的质量,g将尿囊素提取液经微膜过滤,滤液用旋转蒸发仪 50、0.08 MP 旋蒸,获得的浸膏 40 下烘干6。稀释为 0.01、0.1、0.2、0.3 mg/mL 尿囊素溶液,在 225 nm 处测定其吸光度值。1.5 尿囊素抗氧化能力测定分别取不同浓度的尿囊素提取液、VC溶液、VE溶液各 3 mL 于试管中,各加入 1 mL DPPH 配制液,摇匀避光静置 30 min,在 517 nm 处测定吸光值,平行测定 3 次。DPPH 自由基清除率=(1-A测定-A对照A空白)100%式中:A测定为尿囊素提取液+DPPHA对照为尿囊素提取液+无水乙醇A空白为无水乙醇+DPPH1.6 聚合草根尿囊素体外抑菌实验采用 K-B 琼脂扩散法。分别将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌接种于 LB 培养基中,震荡培养 20 h,将培养物稀释至 10-3,将菌液均匀涂布在 LB 培养基表面。将尿囊素提取液分别稀释成不同浓度溶液(0.5、0.1、0.05 mg/mL),以无菌水作对照。滤纸片放入其中浸泡 20 min,用无菌镊子夹取滤纸片平铺于含菌平板上,37 恒温培养箱中培养 14 16 h,观察有无抑菌圈。采用十字交叉法测量抑菌圈直径。重复三次,求平均值。2 结果与分析2.1 不同因素对聚合草根尿囊素得率的影响2.1.1 乙醇浓度对聚合草尿囊素得率的影响由图 1 可以看出,尿囊素得率随乙醇浓度的增加呈先上升后下降的趋势。乙醇浓度达到 60%时,尿囊素得率为 0.71 mg/g,随着乙醇浓度的继续升高,尿囊素得率降低。尿囊素得率受乙醇浓度影响极为显著(P0.05)。33何金环,等:聚合草根中尿囊素的提取及其性质分析图 1 乙醇浓度对尿囊素得率的影响图 2 料液比对尿囊素得率的影响2.1.3 超声功率对尿囊素得率的影响超声波能够加快细胞破壁,有利于尿囊素的溶出。图 3 表明,超声功率为 300 W 时,尿囊素的得率最高。但超声功率过高会导致溶液快速升温,破坏尿囊素结构。超声功率对尿囊素得率的影响极为显著(P0.01)。2.1.4 提取温度对尿囊素得率的影响温度可以加快分子运动,有利于尿囊素从胞内溶出。图4 显示,提取温度为 60 时,尿囊素得率呈现峰值。提取温度为 70 时,尿囊素得率明显下降,原因是温度过高导致尿囊素分解或者结构遭到破坏。提取温度对尿囊素得率影响极为显著(P0.01)。2.1.5 提取时间对尿囊素得率的影响由图 5 看出,提取时间为 35 min 时,尿囊素得率最大。提取时间对尿囊素得率的影响显著(P提取温度超声功率。表 3 可以看出,乙醇浓度对尿囊素得率影响极为显著(P0.01),提取时间影响显著(P0.05)。根据正交试验结果分析可知,最佳提取工艺为 A2B2C2 即乙醇浓度60%、提 取 温 度 60、超 声 功 率 300 W、提 取35 min,尿囊素得率为 0.85 mg/g。表 2 尿囊素提取条件的正交优化试验号ABC尿囊素得率/(mg/g)111110.71212220.82313330.57421230.77522310.81623120.74731320.35832130.47933210.34K12.101.831.921.86K22.322.101.931.91K31.161.651.731.81k10.700.610.640.62k20.770.700.640.64k30.390.550.580.60极差 R0.390.150.070.03表 3 方差分析表差异源SSdFMSFP 值显著性A0.2503720.12653 151.84 0.00654 B0.0342020.01710 20.52 0.04647C0.0084720.004235.080.16477-误差0.0016720.00083注:P0.01 极显著();P0.05 显著();-表示不显著2.3 聚合草尿囊素抗氧化能力分析由图 6 可知,在 0.10.3 mg/mL 浓度范围内,尿囊素提取液、维生素 C、维生素 E 对 DPPH 自由基清除率随浓度的增加逐渐上升。尿囊素对 DPPH自由基清除率低于相同浓度的维生素 C 溶液,高于相同浓度维生素 E 溶液。当浓度为 0.3 mg/mL 时,尿囊素对 DPPH 清除率高达 68.32%。图 6 尿囊素对 DPPH 自由基的清除能力2.4 聚合草尿囊素抑菌能力测定由图 7、图 8 可知,尿囊素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用。1 mg/mL 尿囊素对金黄色葡萄球菌(抑菌直径=39 mm)、大肠杆菌(抑菌直径=22 mm)抑菌能力突出。0.5 mg/mL 尿囊素对金黄色葡萄球菌的抑制能力较强(抑菌直径=29 mm)(图 8),对大肠杆菌的抑制能力一般(抑菌直径=12 mm),说明尿囊素对革兰氏阳性细菌更为敏感。0.1 mg/mL 尿囊素几乎无抑菌作用。水:对照组;1:1 mg/mL 尿囊素;2:0.5 mg/mL 尿囊素;3:0.1 mg/mL 尿囊素图 7 尿囊素对大肠杆菌的抑菌效果53何金环,等:聚合草根中尿囊素的提取及其性质分析水:对照组;1:1 mg/mL 尿囊素;2:0.5 mg/mL 尿囊素;3:0.1 mg/mL 尿囊素图 8 尿囊素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果3 讨论本试验得到聚合草根尿囊素最优提取条件为乙醇浓度 60%、超声功率 300 W、提取温度 60,尿囊素得率 0.85 mg/g。王洪伦等7从白刺中提取尿囊素,杨帆等8从山药中提取尿囊素,获得最适乙醇浓度均与本试验结果一致。刁全平等9以玉米须为原材料提取尿囊素,所用乙醇浓度为 80%,比本试验乙醇浓度高。提取温度为 60 时,尿囊素得率最高,这与杨帆等8采用的提取最适温度 61 基本相近,但高于小麦中尿囊素提取的最适温度40 10。温度过高可能会导致尿囊素分解。本试验表明,随着尿囊素浓度的增大,尿囊素对 DPPH 自由基清除率增加,说明尿囊素具有较强的抗氧化能力。尿囊素对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑制能力大于对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑制能力。阳性菌细胞壁富含磷壁酸,而阴性菌细胞壁磷壁酸含量低。尿囊素是含氮化合物,带正电荷,能通过中和细胞壁的电荷,改变膜的渗透压,破坏菌体细胞内的离子稳态,阻断营养物质的输送,从而抑制细菌生长。参考文献:1 Rentsch D,Schmidt S,Tegeder M.Transporters for uptake and allocation of organic nitrogen compounds in plantsJ.FEBS Letter.2007,581(12):2281-2289.2 张一名,褚卓栋,冯雪,等.尿囊素在植物抗逆应答中的作用J.植物生理学报,2017,53(07):1131-1138.3 Marzook F,Marzook E,ElSonbaty S,et al.Allantoin may modulate aging impairments,symptoms and cancers J.Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences,2021,34(04):1377-1384.4 王慧飞,冯雪,张一名,等.植物中尿素循环相关酶及代谢产物研究进展J.云南农业大学学报(自然科学),2018,33(02):334-342.5 董双涛,李宝霞,沈丹丹.ICP-MS 法测定聚合草根中 6种无机元素的含量J.承德医学院学报,2020,37(01):77-78.6 李落叶,杨晓朱,雷梦英,等.薯莨单宁的提取及其抑菌活性研究J.林业与环境科学,2022,38(03):80-85.7 王洪伦,李玉林,丁晨旭,等.正交实验研究白刺种子尿囊素提取工艺J.天然产物研究与开发,2006,18(05):833-835.8 杨帆,王宇鹏,赵华.响应面法优化超声提取山药尿囊素的研究J.粮食与油脂,2020,33(06):81-84.9 刁全平,侯冬岩,回瑞华,等.HPLC 法测定玉米须中尿囊素的含量J.鞍山师范学院学报,2013,15(02):35-37.10 Sowa I,Paduch R,Strzemski M,et al.Proliferative and antioxidant activity of Symphytum officinale root extraction J.Natural Product Research,2018,32(05):605-609.(责任编辑:刘永祥)63