具有抑制酪氨酸酶活性乳酸菌的筛选及其成分分析.pdf

生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 193具有抑制酪氨酸酶活性乳酸菌的 筛选及其成分分析张 雪，李雪峰，胡瑞峰，郭万春，刘学军*（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130000）摘 要：以抑制酪氨酸酶活性为筛选指标，对5 株乳酸菌发酵上清液、菌体细胞和破碎提取物的酪氨酸酶抑制活性和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率进行分析，结果表明，菌株发酵上清液抑制酪氨酸酶能力远高于菌体细胞和破碎提取物，其中MNJ-9菌株发酵上清液抑制酪氨酸酶能力可达68.9%。菌体细胞和破碎提取物仅为50.9%和34.8%。MNJ-9菌株发酵上清液对DPPH自由基清除能力可达93.1%。因此，对MNJ-9菌株进行16S rDNA菌种鉴定。基于液相色谱-质谱非靶向代谢组学对MNJ-9菌株发酵上清液进行主要成分分析。对其主要成分的10 种化合物进行抑制率测定，结果表明，5-氨基戊酸抑制率最高。将5-氨基戊酸对小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）进行细胞毒性实验、黑色素含量测定、细胞酪氨酸酶活性测定评价其美白能力。结果表明，5-氨基戊酸质量浓度为70 g/mL连续培养72 h时细胞存活率80%，细胞无明显毒性；质量浓度为1070 g/mL时，细胞内黑色素含量和酪氨酸酶活性分别为85.4%45.2%和76.53%40.5%，说明5-氨基戊酸具有一定的美白能力。关键词：乳酸菌；酪氨酸酶抑制；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基；发酵上清液；5-氨基戊酸；B16F10细胞Screening and Compositional Analysis of Lactic Acid Bacteria with Tyrosinase Inhibitory ActivityZHANG Xue,LI Xuefeng,HU Ruifeng,GUO Wanchun,LIU Xuejun*(School of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130000,China)Abstract:In this study,the fermentation supernatant,cells and disrupted cell supernatant of five strains of lactic acid bacteria(LAB)were screened for tyrosinase inhibitory activity and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging capacity.The results showed that the tyrosinase inhibitory activity of the fermentation supernatant was much higher than that of the cells and the disrupted cell supernatant.The percentage inhibition of tyrosinase activity by the fermentation supernatant of strain MNJ-9 was 68.9%compared to only 50.9%with the cells and 34.8%with the disrupted cell supernatant.The fermentation supernatant of strain MNJ-9 scavenged 93.1%of DPPH radical.Meanwhile,MNJ-9 was identified by 16S rDNA gene sequencing.The major components of the fermentation supernatant of MNJ-9 were investigated using untargeted metabolomics based on liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS).The tyrosinase inhibitory activity and DPPH radical scavenging capacity of 10 of the major components were measured.The results showed that 5-aminovaleric acid had the highest tyrosinase inhibitory activity and DPPH radical scavenging capacity.The cytotoxicity of 5-aminovaleric acid on mouse melanoma cells(B16F10),and its impact on the melanin content and tyrosinase activity of B16F10 cells were determined to evaluate its whitening ability.The results showed that the cell survival rate was equal to or over 80%after culture for 72 h with 70 g/mL of 5-aminovaleric acid,indicating no apparent cytotoxicity.At 5-aminovaleric acid concentrations of 1070 g/mL,the intracellular melanin content and tyrosinase activity were 85.4%45.2%and 76.53%40.5%,respectively.This indicates that 5-aminovaleric acid has some whitening ability.Keywords:Lactobacillus;tyrosinase inhibition;1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical;fermentation supernatant;5-aminopentanoic acid;B16F10 cellsDOI:10.7506/spkx1002-6630-20221224-233中图分类号：TS201.3 文献标志码：A文章编号：1002-6630（2023）18-0193-07收稿日期：2022-12-24基金项目：吉林省科技发展计划项目（20210202057NC）第一作者简介：张雪（1996）（ORCID:0000-0002-2918-8014），女，硕士研究生，研究方向为果蔬贮藏与加工。E-mail:*通信作者简介：刘学军（1963）（ORCID:0000-0001-6343-3928），男，教授，博士，研究方向为肉类食品加工、水产品加工及功能食品。E-mail:194 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程引文格式：张雪,李雪峰,胡瑞峰,等.具有抑制酪氨酸酶活性乳酸菌的筛选及其成分分析J.食品科学,2023,44(18):193-199.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221224-233.http:/ZHANG Xue,LI Xuefeng,HU Ruifeng,et al.Screening and compositional analysis of lactic acid bacteria with tyrosinase inhibitory activityJ.Food Science,2023,44(18):193-199.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221224-233.http:/随着经济社会的发展，皮肤美白或祛斑行业出现了巨大的商机1。黑色素在皮肤特定部位的过度产生和积累会导致色素沉着过度2，如黄褐斑、雀斑和老年斑和黑色素瘤3。酪氨酸酶在黑色素合成中起主要作用，在食品工业中，它也是新鲜切割的水果和蔬菜酶促褐变的重要原因之一，因此，在探索和开发酪氨酸酶抑制剂方面做出了大量研究4。在参与黑色素生物合成的酶促反应中，酪氨酸酶（多功能含铜金属酶）作为限速酶起着核心作用。酪氨酸酶通过产生L-3,4-二羟基苯丙氨酸（2,3-dihydroxy-L-phenylalanine，L-DOPA）使用双功能单酚酶和二酚酶活性催化L-酪氨酸氧化为DOPA-醌，从而合成真黑素5。由植物、真菌和细菌产生的酪氨酸酶抑制剂因其低毒性和生物利用性而被视为有吸引力的潜在皮肤美白剂，特别是对于食品和化妆品应用6。并且许多本土植物提取物的酪氨酸酶抑制活性已在韩国、巴西、日本和孟加拉国报道7。尽管已经在植物中鉴定出几种酪氨酸酶抑制剂，包括酚类物质、类固醇和生物碱，但对微生物来源的候选抑制剂研究相对较少8。因此，只有少量抑制酪氨酸酶的细菌代谢物，如生物碱和大环内酯类药物已被鉴定出来9。益生菌是通过定植在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。这些化合物具有免疫调节、抗癌、抗衰老和抗菌作用10。Pourramezan等11报道一些益生菌具有抗氧化作用，可促进皮肤健康；一些临床实验表明通过服用植物乳杆菌以及乳酸菌裂解物可改善皮肤水合作用，提高皮肤屏障功能，抗光老化文献12-14表明双歧杆菌IDCC-4201和植物乳杆菌IDCC-3501显示出有效的抗酪氨酸酶能力，减少黑色素合成，并改变与黑色素生成途径相关的蛋白质表达。用植物乳杆菌菌株TWK10发酵的豆浆乙醇提取物已被证明具有抗黑色素生成特性，并且大豆苷元和染料木黄酮已被证明导致这些色素减退效应15。作为一种传统的收敛止血中草药，纹状芽孢杆菌已被广泛用于治疗127 种不同的出血性疾病。此外，纹状芽孢杆菌自古以来就是一种美容药，最早的古代记录可以追溯到2 000年前，传统上用于去除雀斑和光滑皮肤16。美白功效评价主要包括体外酪氨酸酶抑制能力的测定、抗氧化实验、美白成分分析17。因此，本研究选取5 株乳酸菌进行系统评价其发酵上清液、菌体细胞和破碎提取物的酪氨酸酶抑制活性和抗氧化能力。选取最优菌株进行菌种鉴定。对其乳酸菌发酵上清液成分进行液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）联用的非靶向代谢组学分析，鉴定并研究具有酪氨酸酶抑制活性代谢物。通过评估代谢物对小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）抗氧化活性、酪氨酸酶活性和黑色素含量，评估其美白能力。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 样品样品为采集自新疆奶疙瘩、阿勒泰腊肠、南昌腊肠、延边辣白菜不同地区的特色食源性物质中分离筛选出5 株乳酸菌，于本实验室80 条件下保存，用于本实验需要。具体样品信息见表1、图1。表 1 样品菌株信息Table 1 Information on lactic acid bacteria strains investigated in this study样品编号来源钙圈革兰氏阳性过氧化氢酶MNJ-9新疆奶疙瘩SC-4新疆奶疙瘩MNJ-8阿勒泰腊肠FM-4延边辣白菜AC-4南昌腊肠注：.阳性；.阴性。下同。MNJ-9AC-4图 1 部分菌落在显微镜下菌落形态Fig.1 Microscopic morphology of selected strains1.1.2 试剂L-DOPA、蘑菇酪氨酸酶、曲酸 上海源叶生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、氢氧化钠 长春翊博生物科技有限公司；1,1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）、-黑色素细胞刺激素激素（-melanocyte-stimulating-hormone，-MSH）生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 195美国Sigma公司；5-氨基戊酸、(2S)-2-羟基-3-苯基丙酸乙酯、左旋肉碱、去甲肾上腺素、2-(三甲基氮胺基)乙酸酯、6-羟基己酸、4-甲基-5-噻唑乙醇、2-苯基乙醇、6-氨基己酸、2-酮戊二酸 麦克林生物科技有限公司；小鼠皮肤黑色素瘤细胞（B16F10）、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（multiple table tournament，MTT）、曲拉通X-100 大连博格林生物科技有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、高糖（Dulbeccos modification of Eagles medium，DMEM）、胰酶、胎牛血清、青-链霉素（双抗）美国Gibco 公司；所有实验分离所用的有机溶剂都为分析纯。1.2 仪器与设备HED-SY96S多功能酶标仪 北京生物有限公司；HAD-752N紫外-可见分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；XDS-1倒置显微镜、INCO108 CO2培养箱 日本Sanyo公司；KDC-1042低速离心机 江苏佳能科学仪器有限公司；HH-4B恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；Vanquis液相色谱-Q Exactive Focus质谱联用仪（配有电喷雾电离源及Xcalibur1.2数据处理系统）苏州帕诺米克生物医药科技有限公司。1.3 方法1.3.1 菌株培养及样品制备5 株菌在MRS肉汤培养基中37 静置培养16 h，传代3 次，取活化的菌液4、8 000g离心10 min后收集发酵上清液和菌体。发酵上清液经过0.22 m的水系滤膜过滤，得到为发酵上清液。菌体用超纯水洗涤3 次后重悬，并将菌体数调整为109 CFU/mL，分为2 份。1 份菌液作为菌体细胞，另一份经冰浴超声破碎细胞（300 W，工作2 s，暂停2 s，共10 min），破碎液于4、10 000g离心15 min，收集上清液，镜检无完整细胞，即为破碎提取物。1.3.2 抑制酪氨酸酶乳酸菌株的筛选1.3.2.1 乳酸菌抑制酪氨酸酶能力的测定参照文献18并稍加改进，向96 孔板中加入40 L PBS和40 L 150 U/mL 酪氨酸酶溶液，然后加入40 L样品溶液（A4）。将96 孔板密封后放在37 的水浴锅中水浴10 min。此后，向孔中加入 40 L 5 mol/L L-DOPA。水浴5 min后，用酶标仪在475 nm波长处测吸光度。通过添加40 L PBS代替样品溶液设置空白（A1）。通过加入40 L PBS代替酪氨酸酶溶液设置空白对照（A2）和实验对照（A3）。酪氨酸酶抑制率按式（1）计算：?/%?1?100A4?A3A1?A2（1）式中：A4为PBS酪氨酸酶样品吸光度；A3为PBS样品左旋多巴吸光度；A2为PBS酪氨酸酶左旋多巴的吸光度；A1为PBS左旋多巴吸光度。1.3.2.2 乳酸菌抗氧化能力的测定DPPH自由基清除能力测定参照文献19并稍加改进。分别取1 mL发酵上清液、菌体细胞、破碎提取物，加入浓度0.2 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液1 mL，依次加入试管中混匀后在室温下避光反应30 min，立即在517 nm波长处测定样品的吸光度，用蒸馏水作空白对照。DPPH自由基清除率按式（2）计算：DPPH?/%?1?100Bi?BjBc（2）式中：Bi为1 mL样品1 mL DPPH吸光度；Bj为1 mL样品1 mL无水乙醇吸光度；Bc为1 mL无水乙醇1 mL DPPH吸光度。1.3.3 乳酸菌菌株的鉴定1.3.3.1 生理生化反应将筛选好的菌株MNJ-9用于生化试剂盒进行生理生化实验，参考常见细菌系统鉴定手册20。对应试菌株初步鉴定。1.3.3.2 菌株的16S rDNA鉴定将筛选好的菌株送到生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rDNA测序并鉴定。1.3.4 LC-MS分析抑制酪氨酸酶活性物质1.3.4.1 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm 150 mm，1.8 m）；柱温40；流速0.25 mL/min，进样量2 L。1.3.4.2 质谱条件电喷雾离子源；碰撞能量为30 eV；毛细管温度 325；一级离子扫描范围 m/z 1001 000。1.3.5 细胞分析1.3.5.1 细胞培养与分组参考文献21将小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）用专用培养基培养，条件为37、5%CO2，取对数期细胞于后续实验。实验分组；空白组（正常培养，没有添加任何试剂）、模型组（-MSH诱导）、样品组（-MSH诱导样品10、30、50、70 g/mL）、阳性对照组（-MSH诱导曲酸70 g/mL）。1.3.5.2 细胞活力分析采用MTT法22检测样品对B16F10细胞增值的影响。将B16F10细胞接种在密度为8105 个/mL的96 孔板中。附着后，将新鲜DMEM和样品分别加入细胞后培养24、48、72 h。接下来，将细胞液替换为含有100 L MTT质量浓度0.5 mg/mL的DMEM，并在37、5%CO2下培养2 h。弃去培养基并加入100 L DMSO后，在490 nm波长处测吸光度。细胞存活率按式（3）计算：196 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程?/%?100As?AbAc?Ab（3）式中：As为实验孔（细胞、MTT溶液、药物溶液）吸光度；Ac为对照孔（细胞、MTT溶液，没有药物溶液）吸光度；Ab为空白孔（培养基和MTT溶液，无细胞）吸光度。1.3.5.3 细胞内黑色素含量的测定参考已有研究22将B16F10细胞按照1.3.5.1节实验分组方式培养72 h后，除去培养基后需要用PBS洗涤2 次，并通过胰蛋白酶-EDTA切除细胞并离心以使细胞沉降。之后，除去含胰蛋白酶-EDTA的培养液，将离心管底部沉淀的细胞用PBS均匀分散，然后离心。将沉淀在离心管底部的沉淀通过加入1 mol/L NaOH溶液80 加热2 h，并与涡旋混合振荡器均匀混合以溶解细胞中的黑色素。黑色素的吸光度于在405 nm波长处测定。曲酸用作酪氨酸酶活性测定的阳性对照。黑色素相对含量按式（4）计算：?/%?100A?A?（4）1.3.5.4 细胞内酪氨酸酶活性测定为了测定细胞内酪氨酸酶活性，将B16F10细胞接种在密度为8105/mL的96 孔板中23。用含有不同质量浓度样品（10、30、50、70 g/mL）的DMEM替换培养基，并将细胞孵育72 h。然后除去培养基，并用PBS洗涤细胞。然后将含有1%Triton X-100的180 L PBS加入到每个孔中，并将板摇动10 min。接下来，加入20 L的1 mg/mL L-DOPA溶液，并将细胞在37 孵育60 min。于475 nm波长处测定吸光度评估酪氨酸酶活性。?/%?100A?A?（5）1.4 数据处理每个处理组设置重复3 次，使用GraphPad软件绘图。使用SPSS 22.0软件进行差异显著性分析，P0.05，差异显著。2 结果与分析2.1 抑制酪氨酸酶乳酸菌菌株的筛选2.1.1 乳酸菌菌株抑制酪氨酸酶能力的测定由图2可知，5 株菌各组分均表现出一定的抑制酪氨酸酶能力，但抑制能力差异较大。各组分发酵上清液的抑制率显著高于其他2 个组分（P0.05），其中MNJ-9乳酸菌的抑制率最高，可达68.9%。菌体细胞组和破碎提取物的抑制能力较弱，仅为50.9%和34.8%。而AC-4破碎提取物抑制酪氨酸酶能力最低（7.87%）。一些乳酸菌发酵上清液中多肽和胞外多糖多糖分子已被证明是天然抗氧化剂，在清除自由基和抑制体内酪氨酸酶有较好的表现24，研究表明乳酸菌LRH113发酵上清液具有美白、保湿、抗氧化等功效。抑制酪胺酸酶活性为曲酸的84.4%25。据报道，益生菌有助于预防和治疗皮肤病，例如色素紊乱和黑色素瘤，并通过抑制酪氨酸酶抑制水果和蔬菜的酶促褐变26。0MNJ-9SC-4MNJ-8FM-4AC-460402080DcCcBcABcAcBaAbAaAbBcCbCaDbDaEa?/%?大写字母不同表示不同菌株之间差异显著，小写字母不同表示同一株菌之间差异显著（P0.05）。图3同。图 2 乳酸菌菌株抑制酪氨酸酶能力测定结果Fig.2 Tyrosinase inhibitory activity of LAB strains2.1.2 乳酸菌菌株抗氧化能力的测定由图3可知，5 株菌各组分均表现出一定的DPPH自由基清除能力，但抑制能力差异较大。发酵上清液的抑制率显著高于其他2 个组分（P0.05）。其中MNJ-9清除率最高可达93.1%。破碎提取物清除率AC-4最低12.9%。以上结果表明，菌种MNJ-9发酵上清液的抑制酪氨酸酶能力和自由基清除能力最高。研究发现27，分离自发酵肉制品的30 株乳酸菌的菌体细胞和胞内提取物的DPPH自由基清除活性较弱，而发酵上清液的DPPH自由基清除活性可高达91.24%，与本实验结果一致。抗氧化剂是酪氨酸酶活性和黑色素产生的良好抑制剂。实际上，某些抗氧化剂已被用作黑色素生成抑制剂，例如红花黄-红花黄色素的主要成分，显示出抗氧化和抗黑色素生成活性28。0MNJ-9SC-4MNJ-8FM-4AC-460402010080EcDcCcBcAcBaCaAaAbBbDbCbEbDaEaDPPH?/%?图 3 乳酸菌菌株抗氧化能力的测定结果Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of LAB strains2.2 乳酸菌菌株的鉴定2.2.1 生理生化鉴定由表2可知，参照常见细菌系统鉴定手册初步判断菌株MNJ-9为肠球菌属（Enterococcus sp.）。生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 197表 2 菌株MNJ9生理生化鉴定结果Table 2 Physiological and biochemical identification of strain MNJ9项目结果项目结果七叶苷山梨醇纤维二糖蔗糖麦芽糖棉子糖甘露醇菊糖明胶液化阿拉伯糖H2O2酶实验H2S实验水杨苷乳糖2.2.2 16S rDNA鉴定由图4可知，测序菌株MNJ-9的目的片段序列为1 200 bp。利用BLAST软件，从GenBank中选择10 个菌株的16S r DNA基因序列，利用MEGA 5软件构建系统发育树，结果见图5，菌株MNJ-9与NR 114742.1 Enterococcus faecium strain DSM 20477亲缘关系达100%。确定菌株MNJ-9为屎肠球菌（E.faecium）。Marker3 000 bp2 000 bp1 500 bp1 000 bp800 bp500 bp400 bp300 bp200 bp100 bpMNJ9图 4 菌株MNJ-9的16S rDNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA genes from strain MNJ90.0180NR_043793.1 E.gilvus strain ATCC BAA-350NR_114453.1 E.malodoratus strain ATCC 43197NR_113908.1 E.raffinosus strain NBRC 100492NR_042389.1 E.devriesei strain LMG 14595NR_117976.1 E.viikkiensis strain IE3.2NR_114015.1 E.thailandicus strain NBRC 101867NR_114742.1 E.faecium strain DSM 20477NR_113906.1 E.mundtii strain NBRC 100490NR_113935.1 E.villorum strain NBRC 100699NR_156076.1 Vagococcus humatus strain C25M99099845054100100图 5 菌株MNJ-9基于16S rDNA的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of strain MNJ-9 based on 16S rDNA gene sequences2.3 基于LC-MS鉴定乳酸菌发酵上清液主要成分基于LC-MS非靶向的方式对MNJ-9发酵上清液进行分析，所得数据进行生物信息学分析。MNJ-9发酵上清液的正负离子流图如图6所示。共鉴定出发酵上清液化学成分425 种。其中正离子模式229 种，负离子模式196 种。表3显示了发酵上清液中主要成分的含量，每个成分占总量1.5%以上。01789 10 11 12 13654321435a?6-?(2S)-2-?-3-?6-?241?109?/min01789 10 11 12 13654321461210b?2-?5-?4-?-5-?2-?2-(?)?482?109?/mina.正离子流图；b.负离子流图。图 6 菌株发酵上清液的LC-MS分析Fig.6 LC-MS analysis of the fermentation supernatant表 3 发酵上清液前10 种主要成分Table 3 Ten major constituents of the fermentation supernatant峰号主要成分保留时间/s相对峰面积/%15-氨基戊酸1367.266 973 672(2S)-2-羟基-3-苯基丙酸乙酯330.64.908 490 173左旋肉碱92.14.178 683 224去甲肾上腺素 205.73.753 568 3752-(三甲基氮胺基)乙酸酯 92.62.724 208 8766-羟基己酸288.72.128 501 6474-甲基-5-噻唑乙醇293.11.793 240 1082-苯基乙醇 3351.727 891 1196-氨基己酸292.81.682 427 72102-酮戊二酸 195.11.594 857 63酪氨酸酶在黑色素生成中起重要作用。可以通过抗氧化和抑制酪氨酸酶实现对黑色素生成的抑制29。如图7 所示，10 种化合物都具有抑制酪氨酸酶活性和DPPH自由基清除能力，但抑制率最强的为5-氨基戊酸（最高可达69.5%和93.4%），(2S)-2-羟基-3-苯基丙酸乙酯可达63.5%和85.4%，左旋肉碱仅为45.6%和59.2%。综上实验可知，5-氨基戊酸抑制酪氨酸酶活性和DPPH自由基清除率效果最优。5-氨基戊酸类抗肿瘤药物是近年来兴起的药物开发的新领域，目前全世界发病率最高的癌症依次为乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、皮肤非黑素瘤、胃癌和肝癌30。传统的化疗药物具有很大的副作用，如恶心呕吐、毛发脱落、腹胀腹泻等。5-氨基戊酸类药物的发现为抗肿瘤药物开发提供了新的窗口31。(2S)-2-羟基-3-苯基丙酸乙酯存在于各种食物中，如蜂蜜、泡菜和酸面团。它对食源性致病菌和腐败霉菌表现出多功能的抗菌活性32。肉碱是一种水溶性氨基酸衍生物，存在于身体的许多细胞中33。左旋肉碱补充剂可能通过改善糖尿病患者的葡萄糖摄取、贮存和氧化影响葡萄糖代谢，这些198 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程抗氧化和抗炎特性在血脂异常、胰岛素敏感性和蛋白质营养中起着有益的作用34。05-?(2S)-2-?-3-?2-(?)?6-?4-?-5-?2-?6-?2-?60201008040?/%DPPH?/%eededeabcabccdabcdaa bcdcdeaababacdbcdabcabc?DPPH?同一指标不同字母表示差异显著（P0.05）。图 7 10 种化合物的酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除能力测定结果Fig.7 Tyrosinase inhibitory activity and DPPH radical scavenging capacity of 10 major compounds of the fermentation supernatant2.4 细胞分析2.4.1 细胞存活率任何潜在的化疗保护物质（如5-氨基戊酸）的进展必须首先涉及对其安全性和敏感性的评估27。实验进行了MTT测定，以评估不同质量浓度5-氨基戊酸对B16F10细胞的影响。在保证不影响细胞存活率的前提下，若对黑色素合成具有一定的抑制效果，则说明该药物在细胞水上具有一定的美白作用35。分别取空白组和样品组连续处理72 h，由图8可知，样品组质量浓度逐渐提高，细胞存活率逐渐降低，70 g/mL质量浓度下，72 h内细胞存活率80%，视为无细胞毒性，即对体外培养的小鼠B16F10黑色素瘤细胞无明显毒性；因此，70 g/mL样品不会影响后续细胞实验的结果。0?1030507060402010080abcdedcdccbcaba?/%?/?g/mL?24 h48 h72 h小写字母不同表示不同质量浓度差异显著（P0.05），下同。图 8 5-氨基戊酸对B16F10细胞存活率的影响Fig.8 Effect of 5-aminovaleric acid on the survival rate of B16F10 cells2.4.2 细胞内黑色素含量皮肤黑色素细胞的含量及其合成黑色素的能力主要决定了皮肤颜色深浅。为研究5-氨基戊酸抑制B16F10细胞黑色素含量的能力，首先构建-MSH诱导黑色素表达模型，如图9所示，与空白组比较，-MSH对B16F10细胞诱导后，细胞内黑色素含量明显增加，说明模型构建成功。处理72 h后随着5-氨基戊酸质量浓度升高，细胞内黑色素含量逐渐降低，并呈现剂量依赖。5-氨基戊酸质量浓度1070 g/mL时，细胞内黑色素含量由85.4%下降为45.2%。结果表明，5-氨基戊酸对细胞内黑色素生成具有抑制作用，在细胞水平具有良好的效果。080dabcefg100604020?/%?/?g/mL?10305070?10 g/mL 30 g/mL 50 g/mL 70 g/mL图 9 5-氨基戊酸对B16F10细胞内黑色素含量的影响Fig.9 Effect of 5-aminovaleric acid on melanin content in B16F10 cells2.4.3 细胞内酪氨酸酶活性酪氨酸酶通过催化B16F10细胞内的酪氨酸生成黑色素，是黑色素合成的主要限速酶，其活性决定黑色素的合成。通过抑制细胞内酪氨酸酶的活性，可抑制细胞内黑色素的产生36。由图10可知，与模型组相比，5-氨基戊酸和曲酸均表现出对细胞B16F10细胞内酪氨酸酶活性抑制作用。5-氨基戊酸对细胞内酪氨酸酶的抑制作用呈剂量依性，质量浓度为1070 g/mL时，细胞内酪氨酸酶相对活性由76.53%下降到40.5%。结果表明5-氨基戊酸对B16F10细胞的酪氨酸酶活性有明显抑制作用。080dabcefg100604020?/%?/?g/mL?10305070?图 10 5-氨基戊酸对B16F10细胞内酪氨酸酶活性影响Fig.10 Effect of 5-aminovaleric acid on tyrosinase activity in B16F10 cells3 结 论本实验比较5 株乳酸菌发酵上清液、菌体细胞和破碎提取物，进行酪氨酸酶抑制率测定和DPPH自由基清生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 199除率分析。结果表明，MNJ-9的发酵上清液抑制酪氨酸酶活性和DPPH自由基能力最强，经鉴定MNJ-9为屎肠球菌。采用非靶向代谢组学分析鉴定了MNJ-9屎肠球菌发酵上清液产生的代谢物。进行10 种主要成分分析。研究表明，5-氨基戊酸有效抑制酪氨酸酶活性。采用小鼠B16F10黑色素瘤细胞作为细胞模型，研究5-氨基戊酸对细胞活力、细胞内酪氨酸酶活性和黑色素合成的影响。结果显示，5-氨基戊酸在保证细胞安全生长的基础上抑制黑色素的生成，而且随着质量浓度增加，抑制酪氨酸酶活性、黑色素合成含量降低，这表明5-氨基戊酸作为酪氨酸酶和黑色素生成的候选抑制剂，可包含在具有皮肤美白化妆品配方中。参考文献：1 LI J X,LI C Y,XIN P,et al.Recent discovery of tyrosinase inhibitors in traditional Chinese medicines and screening methodsJ.Journal of Ethnopharmacology,2023,303:115951.DOI:10.1016/j.jep.2022.115951.2 ZHANG J R,DAI R Y,LIOU Y L,et al.Effects of the melanogenic inhibitor,uracil,derived from Lactobacillus plantarum TWK10-fermented soy milk on anti-melanogenesis in B16F0 mouse melanoma cellsJ.Journal of Functional Foods,2015,17:314-327.DOI:10.1016/j.jff.2015.05.022.3 SAYO K,TOSHINARI T,KAZUTOSHI Y,et al.Inhibitory 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