莱茵衣藻IFT20的原核表达、纯化及多克隆抗体鉴定.pdf

研究论文莱茵衣藻IFT20的原核表达、纯化及多克隆抗体鉴定贾瑞勤1，贾航，郑学超，薛斌2 3，葵（1.天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室，天津30 0 457；2.天津科技大学生物工程学院，天津30 0 457；3.天津科技大学大健康生物技术国家国际科技合作基地，天津30 0 457）摘要：莱菌衣藻鞭毛内运输（intraflagellar transport，IFT)蛋白IFT20是IFT蛋白复合物B(IFT-B)的组分之一。虽然IFT20参与调控细胞内大分子的胞内运输过程，但其作为一个鞭毛蛋白在鞭毛内的详细功能仍有待研究。为了开发高特异性的莱菌衣藻IFT20免源多克隆抗体，作者首先在大肠杆菌中表达了N端6 xHis标签标记的IFT20融合蛋白（6 xHis:IFT20），并对其进行镍柱纯化，将纯化所得6 xHis:IFT20蛋白免疫新西兰大白免。采集3次免疫后的抗血清，利用间接ELISA法测定其效价为1:10 2 40 0。利用proteinA纯化珠对所得抗血清进行了IgG亚型抗体富集，接着用大肠杆菌表达纯化所得N端MBP标签标记的IFT20（M BP:IFT 2 0），并对IgG抗血清进行抗原抗体亲和纯化。经对CC-125藻种全细胞蛋白质提取物进行免疫印迹法鉴定，所得IFT20多克隆抗体特异性较高，适合用于后续莱菌衣藻IFT20鞭毛内运输功能的研究。关键词：莱茵衣藻；鞭毛内运输；IFT20；多克隆抗体中图分类号：Q81文章编号：16 7 3-16 8 9(2 0 2 3)11-0 10 6-0 7樊振川*2,3DOl:10.12441/spyswjs.20210627001Prokaryotic Expression,Purification,and Polyclonal Antibody Identification ofChlamydomonas reinhardti IFT20JIA Ruiqin,JIA Hang,ZHENG Xuechao,XUE Bin23,FAN Zhenchuan2.3(1.State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China;2.College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China;3.ChinaInternational Science&Technology Cooperation Base for Health Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)Abstract:Intraflagellar transport protein 20(IFT20)of Chlamydomonas reinhardti is a componentof the intraflagellar transport complex B(IFT-B).IFT20 is known to be involved in regulatingintracellular transport processes of macromolecules,but its detailed function as a flagellar protein inflagella remains to be investigated.This study aimed to develop highly specific polyclonal antibodiesagainst Chlamydomonas reinhardti IFT20 from rabbit serum to lay the foundation for furtherinvestigation into its flagellar function.To achieve this goal,the N-terminal 6xHis-tagged IFT20fusion protein(6xHis:IFT20)was first expressed in Escherichia coli,and 6xHis:IFT20 was purifiedby Ni-column.The purified 6xHis:IFT20 was then applied to immunize the New Zealand white收稿日期：2 0 2 1-0 6-2 7基金项目：天津科技大学2 0 2 1年度大学生创新创业训练计划项目（2 0 2 110 0 57 2 11)。*通信作者：樊振川(19 7 4一），男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事营养代谢性疾病研究。E-mail:106JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 11 2023修回日期：2 0 2 1-0 8-30研究论文贾瑞勤，等：莱茵衣藻IFT20的原核表达、纯化及多克隆抗体鉴定rabbits.The antiserum was collected after three rounds of immunization,and the titer was determinedto be 1:102 400 by an indirect ELISA method.Subsequently,the obtained anti-serum was purifiedusing protein A purification beads to enrich the IgG subtype antibodies.Next,N-terminalMBP-tagged IFT20(MBP:IFT20)expressed and purified from Escherichia coli was used forantigen-antibody affinity purification of IgG antiserum.The western blotting assay of whole cellprotein extracts from CC-125 identified the high specificity of the obtained IFT20 polyclonalantibodies,making them suitable for future investigations on the flagellar function of IFT20 inChlamydomonas reinhardti.Keywords:Chlamydomonas reinhardti,intraflagellar transport,IFT20,polyclonal antibody鞭毛是一种存在于大多数真核细胞表面的具有运动、感知和信号传导功能的细胞器。鞭毛由鞭毛轴丝、基体和鞭毛膜组成。根据鞭毛轴丝结构不同，将鞭毛分为9+2 型运动纤毛（motilecilia）和9+0型原发性纤毛(primary cilia)2种类型。由于鞭毛不具有蛋白质合成所需的细胞器（如核糖体等）,因此鞭毛生成和维持所需的前体蛋白质和降解产物均需通过鞭毛内运输(intaflagellar transport,IFT)的方式输入和输出鞭毛 2 。19 9 3年发现IFT存在于莱茵衣藻鞭毛中,其颗粒沿着鞭毛轴丝进行双向运输3。IFT颗粒从鞭毛基部到顶部的运输称之为正向运输,这一过程由驱动蛋白-2(kinesin-2)驱动 4l;反之则称之为反向运输,由动力蛋白-1b(dynein-1b)驱动 5。目前已知IFT颗粒由IFT-A和IFT-B共2 个蛋白质复合物组成，其中IFT-A含有6 个蛋白质亚基,通过与动力蛋白-1b偶联来调控IFT反向运输。而IFT-B则由16 个蛋白质亚基组成，通过与驱动蛋白-2 偶联来调控IFT正向运输 7。此外,IFT-B在生化功能关系上可进一步划分为IFT-B1和IFT-B2等2 个亚蛋白质复合物18-9 。生化和遗传实验表明IFT对维持鞭毛生成和信号传导功能是必需的，鞭毛组装缺陷或信号功能缺失可引发一系列统称为纤毛病（ciliopathy）的先天性疾病，其中就包括Bardet-Biedl综合征 10 Joubert综合征 和Meckel综合征2 等。IFT20是IFT-B的一个组成成分，在具鞭毛生物中是高度进化保守的 13。研究表明,IFT20蛋白缺失会导致小鼠视锥细胞鞭毛生物生成受阻，视紫红质无法运送到视锥细胞外节，导致其在细胞内节大量堆积而引发神经退行性病变 1415。此外,IFT20 可以和精子鞭毛蛋白2（SPEF2)相互作用，影响正常的生精导致雄性不孕 0 。因此,研究IFT20的鞭毛生物学功能及其异常表达引发相关疾病的分子机制对于预防、诊断和开发相关药物治疗这些疾病具有十分重要的意义。莱茵衣藻是一种单细胞真核藻类，作为一种模式生物，莱茵衣藻已被广泛应用于鞭毛内运输、组装和功能的研究。因此,作者拟制备高特异性的莱茵衣藻IFT20蛋白多克隆抗体，为后续开展IFT20在莱茵衣藻鞭毛内的功能研究奠定基础。材料与方法1.1材料与试剂1.1.1实验材料大大肠杆菌(Escherichiacoli)表达载体pET-28a(+)和pMAL-c2x、大肠杆菌XL1-blue和BL21(DE3)菌株、莱茵衣藻野生型藻种CC-125:均为作者所在实验室保存。1.1.2实验试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、RNase-M-MLV酶、核酸和蛋白质标准品以及TriZol等：北京全式金生物有限公司；IPTG、卡那霉素、氨芊青霉素、PCR产物纯化试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等：SangonBiotech公司；质粒提取试剂盒：TIANGEN公司；硝酸纤维素膜：美国PALL公司；Protein A SepharoseM CL-4B,Ni SepharoseV 6 FastFlow和 Dextrin Sepharose7M High Performance等：美国GEHealthcare公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗：美国Jackson公司;ECL发光液：德国Millipore公司。1.2实验方法1.2.1莱茵衣藻总RNA提取野生型莱茵衣藻CC-125细胞在-8 0 冻存后置于研钵中,加人液氮将其研磨至粉末状后转移至50 mL离心管中。加入1mL Trizol和2 0 L-巯基乙醇后剧烈振荡,并于室温静置10 min。加入6 0 0 L氯仿-异戊醇（体积食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第11期107JIA Ruiqin,et al:Prokaryotic Expression,Purification,and PolyclonalRESEARCHARTICLEAntibody Identification of Chlamydomonas reinhardtiIFT20比2 4:1），颠倒混匀后加人9 0 L无水乙醇，静置2min。于10 0 0 0 r/min冷冻离心15min，吸取上清液，加人2 倍体积的无水乙醇和0.2 倍体积的醋酸钠，混匀后于-2 0 静置30 min，接着于10 0 0 0 r/min冷冻离心15min。弃上清液，加人2 mL体积分数7 5%的乙醇，充分混匀后于10 0 0 0 r/min冷冻离心8 min。弃上清液，在超净工作台中于室温干燥5min。加人50 LDEPC水,吹匀溶解,测定所获总RNA浓度并验证。混勾5LDNA酶缓冲液,2 LDNA酶,0.5LRNA酶抑制剂和45LRNA样品，将其在37 烘箱中30 min以去除DNA。最后用氯仿-异戊醇和水饱和酚抽提3次，最终获得莱茵衣藻总RNA。1.2.2大肠杆菌表达载体pET-28a（+）-i f t 2 0 和pMAL-c2x-ift20的构建在Phytozome v12.1数据库中搜索if20基因cDNA序列，设计含有EcoRI酶切位点的上游引物IFT20-FOR和含有HindI酶切位点的下游引物IFT20-REV,见表1。以莱茵衣藻野生型藻种CC-125总RNA为模板进行反转录以生成cDNA，并以此cDNA为模板进行t22cDNA扩增。将f22cDNA克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和pMAL-c2x,所得重组表达载体命名为 pET-28a(+)-if20 和 pMAL-c2x-ift20。1.2.3融合蛋白诱导表达将重组表达载体pET-28a（+）-i f t 2 0 和pMAL-c2x-ift20转人大肠杆菌BL21(DE3)细胞并将细菌涂布于LB培养基平板。待转化子形成后，挑取单克隆细菌至LB液体培养基,在37 于2 2 0 r/min培养过夜，而后将其以体积分数5%接种至LB液体培养基中继续培养。当OD6oo达到0.8 1.0 时,加人0.2 mmol/LIPTG诱导蛋白质进行表达，该过程在2 5、2 2 0 r/min下进行68h。离心收集菌体后加入结合缓冲液(50 mmol/LTris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH 7.4，应用于 pET-28a(+)-ift20 体系;2 0 mmol/L Tris-HCl、2 0 0 m m o l/LNaCl、1m m o l/LED T A、p H 7.4，应用于pMAL-c2x-f20体系）,重悬菌体并进行超声破碎，对细菌破碎物进行SDS-PAGE电泳分析，分析融合蛋白质是否存在于上清液中。在融合蛋白质诱导表达过程中，所有培养基都需添加相应抗生素。1.2.4融合蛋白质纯化重悬含有pET-28a(+）-ift20和pMAL-c2x-ift20的菌体于上述结合缓冲液中，超声破碎菌体后将上清液（重组蛋白6 xHis：108JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSUe 11 2023IFT20和MBP：:I FT 2 0 均溶于上清液中)与1mLNiSepharoseTM 6Fast Flow（结合6 xHis:IFT20)或Dextrin Sepharose TM High Performance（结合MBP:IFT20)填料混匀,4过夜。用结合缓冲液漂洗填料10 次，后用洗脱缓冲液（50 mmol/LTris-HCl,150 mmol/L NaCl,500 mmol/L 咪唑,pH 7.4 或20 mmol/L Tris-HCl,200 mmol/L NaCl,1 mmol/LEDTA,10mmol/L麦芽糖,pH7.4）分别针对6 His：:I FT 2 0 和MBP：:I FT 2 0 进行洗脱，收集重组蛋白质并对其进行SDS-PAGE电泳分析。1.2.5动物免疫将6 xHis：:IFT 2 0 蛋白抗原（纯度大于8 5%）送至北京华大蛋白质研发中心有限公司，选择新西兰大白免为免疫动物进行抗血清生成。1.2.6抗血清效价检测抗血清效价检测按文献17的间接ELISA法进行。具体而言,将IFT20包被抗原稀释至10 g/mL，并以10 0 L/孔包被于酶标板。用体积分数5%的脱脂牛奶封闭液对抗原室温封闭1h后弃去。用PBST清洗液洗板3次，加人抗血清室温孵育1h。孵育结束后,用PBST清洗液洗板4次，加人酶标二抗室温孵育30 min。最后加人TMB(3,3,5,5-四甲基联苯胺)溶液显色,利用酶标仪测定其在OD450处的吸光值，效价定义为最大OD值一半时所对应的抗血清稀释倍数。1.2.7IgG亚型抗体富集IgG亚型抗体富集参照文献 18 的方法。取一定量的抗血清和结合缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、p H 7.0)混匀,将其转入装有ProteinA纯化珠的纯化柱中，室温结合1 2 h后，用结合缓冲液漂洗3次。最后用酸性洗脱液（0.1mol/LGlycine,pH3.0)洗脱,中和后保存备用。1.2.8抗原抗体亲和纯化抗原抗体亲和纯化参照文献 19 的方法。用1mmol/L HCl溶胀CNBr-activatedSepharose4B干粉，并用结合缓冲液（0.1mol/L NaHCO3、50 0 mmo l/L Na Cl、p H 8.3）将其 pH值调至8.3。将MBP：:I FT 2 0 蛋白抗原溶于结合液中,与溶胀好的CNBr-activated Sepharose 4B于4过夜。离心后在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液中室温静置 2 4 h。最后用 10 0 mmol/L Tris-HCl 和0.5mol/LNaCl洗脱液（pH8.5)与50 mmol/L甘氨酸和1mol/LNaCl洗脱液(pH3.5)交替洗脱至少8次。将偶联抗原的CNBr-activated Sepharose 4B与经ProteinA富集后的抗体孵育，按照以上IgG亚型抗体富集的方法洗脱抗体，保存备用。研究论文贾瑞勤，等：莱茵衣藻IFT20的原核表达、纯化及多克隆抗体鉴定1.2.9免疫印迹检测免疫印迹检测参照文献 2 0 的方法进行。取2 0 g莱茵衣藻野生型藻种CC-125的全细胞蛋白质提取物进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将分离好的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并利用体积分数5%的脱脂牛奶封闭液对其进行封闭，添加稀释后的纯化抗体室温孵育1h,用TBST 漂洗液（10 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,体积分数0.0 5%Tween-20,pH7.5)漂洗3次。最后加人二抗室温孵育1h，用TBST对其漂洗3次后,用ECL化学发光显色液曝光。2结果与分析2.1大肠杆菌表达载体pET-28a（+)-i f t 2 0 构建以莱茵衣藻野生型藻种CC-125总RNA生成所得cDNA为模板,利用表1中所示上下游引物进行PCR扩增，获得大小为40 0 bp左右的PCR产物。该cDNA扩增产物经EcoRI和Hind II双酶切后克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a（+）,将连接产物转人大肠杆菌XL1-blue感受态细胞，随机挑取2 个转化子提取质粒进行酶切验证，见图1。结果表明,EcoRI和Hind III双酶切可以切出与载体和目的基因大小相符的2 个片段。将酶切验证正确的质粒测序分析后命名为pET-28a(+)-if20。表1IFT20cDNA扩增引物序列Table 1 Primers for the amplification of IFT20 cDNA引物名称IFT20-5-GGAATTCATGGACGCGGTAGATAGAGG-3FORIFT20-5-CCCAAGCTTTTACACGTATGCCGCCCCGC-3REV注：下划线为酶切位点。2.26xHis：:I FT 2 0 重组蛋白诱导表达及纯化将重组表达载体pET-28a(+)-if20转化进人大肠杆菌BL21(DE3）,诱导表达融合蛋白6 xHis：IFT20。将融合蛋白6 xHis：I FT 2 0 进行镍柱亲和纯化，而后对纯化产物进行SDS-PACE电泳分析。如图2 所示,6 xHis:IFT20溶于菌体上清液中，以可溶性蛋白质的形式存在。灰度量化分析表明，纯化后的6 xHis：:I FT 2 0 融合蛋白约占菌体上清液总蛋白质的8 5%，符合免疫蛋白抗原纯度不低于8 5%的要求。收集大约2.5g的6 xHis：:I FT 2 0 融合蛋白用于免疫新西兰大白兔。bpM 1 2500053691000408M:1kbDNA标准品；1 2:2 个转化子所提质粒的EcoRI和Hind II双酶切产物。图1重组质粒pET-28a(+)-ift20的EcoRI和HindII双酶切验证Fig.1 Double restriction digestion verification of therecombinant plasmid pET-28a(+)-ift20 by EcoR Iand Hind IIIM12354615.000-M：蛋白质标准物；1：诱导前全蛋白质；2：诱导后全蛋白质；3：诱导后水溶性（上清液）蛋白质；4：诱导后水不溶（沉淀）蛋引物序列白质；5：流穿液；6 7：漂洗液；8 10：洗脱液。图2 SDS-PAGE检测6 xHis:IFT20融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3）中的表达及后续纯化Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression of 6xHis:IFT20 fusion protein in E.coli BL21(DE3)and itssubsequent purification2.3IFT20抗血清效价检测将6 xHis：I FT 2 0 融合蛋白送至北京华大蛋白质研发中心有限公司免疫新西兰大白免3次，取耳静脉血进行间接ELISA法抗血清效价检测。如图3所示，最大OD值的一半数值处所对应的抗血清稀释倍数为10 2 40 0。因此,所得IFT20抗血清效价为1:102 400。2.4IFT20抗体纯化及其特异性检测2.4.1IFT20抗血清IgG富集兔源抗血清中含有诸多抗体亚型，为获得高亲和性抗IFT20的IgG亚型抗体,我们利用ProteinA纯化珠对IFT20抗血清bp78910-6xHis:IFT20食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第11期109JIA Ruiqin,et al:Prokaryotic Expression,Purification,and PolyclonalRESEARCHARTICLEAntibody Identification of Chlamydomonas reinhardtiIFT202.01.81.61.41.21.00.80.60.40.20图3间接ELISA法测定IFT20抗血清效价Fig.3 Determination of anti-IFT20 polyclonal antiserumtiter by indirect ELISAIgG进行了富集，并对富集得到的IgG进行了免疫印迹检测。如图4所示，抗血清经ProteinA富集后，可以识别莱茵衣藻野生型藻种CC-125全细胞蛋白质提取物中的内源IFT20蛋白质，但多条非特异性蛋白质条带仍然可见，需要对其进一步亲和纯化以提高IFT20抗体的特异性。免疫前血清富集抗血清亲和纯化所得MBP：I FT 2 0 纯度约为9 3.5%。按1.2.8所述实验方法，将纯化后的MBP：:IFT 2 0 融合蛋白与CNBr-activatedSepharose4B偶联，然后按照1.2.8 所述方法对抗IFT20IgG进行抗原抗体亲和纯化，收集纯化后的抗体，保存备用。bpM12bp60006646稀释倍数1000M:1kbDNA标准品；1 2:2 个转化子所提质粒的EcoRI和Hind II双酶切产物。图5重组质粒pMAL-c2x-ift20的EcoRI和HindIII双酶切验证Fig.5IDouble restriction digestion verification of therecombinant plasmid pMAL-c2x-ift20 by EcoR Iand Hind IIM 1 2.3 4 567840870000-55.000-MBP:IFT2025000-M：蛋白质标准品；1：诱导前全蛋白质；2：诱导后全蛋白质；IFT2015000图4免疫印迹法检测抗血清富集IgG识别IFT20的特异性Fig.4Specificity of the antiserum-enriched IgG forrecognizing IFT20 in immunoblotting assay2.4.2IFT20抗体亲和纯化用EcoRI和HindIII对pET-28a(+)-ift20进行酶切获得i20cDNA,并将其克隆至大肠杆菌表达载体pMAL-c2x。将连接产物转人大肠杆菌XL1-blue细胞中，待平板长出转化子后，随机挑取2 个转化子提取质粒进行酶切验证。如图5所示，重组载体经EcoRI和Hind I双酶切得到符合载体和目的基因大小的2 个片段，将测序验证后的载体命名为pMAL-c2x-ift20。将pMAL-c2x-if20转人大肠杆菌BL21(DE3)细胞,诱导表达融合蛋白MBP：I FT 2 0 并进行亲和纯化。如图6 所示，MBP：I FT 2 0 融合蛋白为水溶性蛋白质，110JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSUe 11 20233：诱导后水溶性蛋白质（上清液）；4：诱导后水不溶蛋白质（沉淀）；5：流穿液；6：漂洗液；7 9：洗脱液。图6 SSDS-PAGE检测MBP：I FT 2 0 融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达及后续纯化Fig.6SSDS-PAGE analysis of the expression of MBP:IFT20 fusion protein in E.coli BL21(DE3)and itssubsequent purification2.4.3IFT20抗体免疫印迹特异性检测将纯化后的IFT20抗体稀释50 0 倍，对莱茵衣藻野生型藻种CC-125的全细胞蛋白质提取物进行免疫印迹分析。如图7 所示，纯化后的IFT20抗体可以特异性识别莱茵衣藻内源性IFT20蛋白。2.5讨论研究莱茵衣藻IFT20在鞭毛组装中的功能需要一支高特异性识别内源IFT20蛋白的抗体。在大肠研究论文贾瑞勤，等：莱茵衣藻IFT20的原核表达、纯化及多克隆抗体鉴定亲和纯化抗体免疫前血清25.00015.000-图7 免疫印迹法检测亲和纯化后IFT20抗体识别特异性Fig.7 Specificity of the affinity purified anti-IFT20 forrecognizing IFT20 in immunoblotting assay杆菌中表达了N端6 xHis标签标记的莱茵衣藻IFT20融合蛋白6 xHis：I FT 2 0，经镍柱纯化后获得纯度约8 5%的6 xHis：I FT 2 0 融合蛋白，以该融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔获得IFT20抗血清。然而,用Protein A富集的IFT20 IgG对莱茵衣藻野生型藻种CC-125全细胞蛋白质提取物中的IFT20内源蛋白识别特异性较差，究其原因可能是该抗体的非特异性交叉识别比较严重，反映在免疫印迹上就是非特异性蛋白质杂带过多。这可能是纯化后的6 His：:I FT 2 0 融合蛋白抗原中依然存有非融合蛋白质组分，影响了动物免疫效果，但也可能是免源抗体的特点,其抗血清本身特异性较差。为了进一步提高IFT20抗体的特异性,对Protein A富集的 IgG进行了抗原抗体亲和纯化，免疫印迹检测发现二次纯化的IFT20抗体能特异性识别莱茵衣藻内源性IFT20蛋白。因此，二次纯化策略将采用一种标准程序用来开发后续莱茵衣藻兔源多克隆抗体。在后续抗体测试中,我们将用该IFT20抗体对莱茵衣藻细胞进行免疫荧光染色及免疫共沉淀分析，探索其在这2 种类型的实验中应用的可能性。-IFT203结语鞭毛是一种特异化细胞“天线”，在细胞分裂、发育以及分化中均起着重要作用 2 1。鞭毛组装依赖IFT这一双向运输机制来完成。在这一过程中，IFT-A蛋白复合物单一组分蛋白质缺失将破坏IFT-A稳定性,进而影响IFT反向运输，从而形成膨大的缺陷鞭毛 2 。大部分IFT-B蛋白复合物单一组分如IFT3823、I FT 46 2 4 和IFT547等缺失则只影响IFT正向运输,最终导致鞭毛组装缺陷。少数IFT-B蛋白复合物单一组分如IFT2220、IFT 2 5 2 5 和IFT2726的缺失并不影响IFT正向运输，因此不会影响鞭毛组装。目前已知IFT54缺失破坏了IFT20的稳定性 2 7 ,而IFT20缺失则可导致鞭毛组装受阻 2 8 。这说明IFT20与其他大部分IFT-B单一组分蛋白质一样，在鞭毛组装中起着重要作用。到目前为止,IFT20调控鞭毛组装的分子机制仍不清晰，其功能有待进一步研究。参考文献：1 J ELEY L,YATES L M,GOODSHIP J A.Cilia and diseaseJJ.Current Opinion in Genetics&Development,2005,15(3):308-314.2 WEBB S,MUKHOPADHYAY A G,ROBERTS A J.Intraflagellar transport trains and motors:insights from structure.Seminars in Cell&Developmental Biology,2020,107:82-90.3 J KOZMINSKI K G,JOHNSON K A,FORSCHER P,et al.A motility in the eukaryotic flagellum unrelated to flagellar beatingJ.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1993,90(12):5519-5523.4 J COLE D G,DIENER D R,HIMELBLAU A L,et al.Chlamydomonas kinesin-II-dependent intraflagellar transport(IFT):IFTparticles contain proteins required for ciliary assembly in Caenorhabditis elegans sensory neurons Jj.The Journal of CellBiology,1998,141(4):993-1008.5 J 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