经血间充质干细胞及其培养液对化疗致早发性卵巢功能不全小鼠的治疗作用.pdf

1544生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期DO1:10.3969/j.issn.1004-3845.2023.10.013实验研究经血间充质干细胞及其培养液对化疗致早发性卵巢功能不全小鼠的治疗作用余柯达，毛佳婷，柴娟，包云，师帅*（金华市人民医院生殖医学中心，金华32 10 0 0）【摘要】目的探讨经血间充质干细胞（MenSCs)及其培养液(MenSCs-CM)对化疗致早发性卵巢功能不全(POI)小鼠的治疗作用。方法将健康的雌性ICR小鼠分为4组：对照组、POI组、POI+MenSCs组和 POI+MenSCs-CM组。POI组、POI+MenSCs组和POI+MenSCs-CM组用环磷酰胺(CTX)建立POI模型，建模成功后分别进行对应治疗处理。测量小鼠卵巢脏器系数，HE染色检查卵巢卵泡情况,ELISA测定血清卵泡刺激素（FSH)和雌激素（E,水平，TUNEL法观察卵巢细胞凋亡情况，交配实验检测生育力，并对4组进行比较。结果治疗第7 天和第14天,POI组的卵巢脏器系数均显著低于对照组（P0.05）,PO I+M e n SC s 组和POI+MenSCs-CM组均显著高于POI组（P0.05)；治疗第7 天和第14天,POI组的血清FSH水平显著高于对照组（P0.05）,PO I+M e n SC s 组和POI+MenSCs-CM组均显著低于POI组（P0.05）；治疗第14天，POI+MenSCs组和 POI+MenSCs-CM组的血清 Ez水平均显著高于 POI组(P0.05）。PO I+M e n SC s 组和 POI+MenSCs-CM组的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡数量均显著多于POI组（P0.05）,闭锁卵泡数显著少于POI组（P0.05）。TUNEL法结果表明，调亡细胞大部分为成熟卵泡周边及内部的颗粒细胞（GCs）,PO I+M e n SC s 组和POI+MenSCs-CM组的调亡指数均显著小于POI组(P0.05),且两组的产仔数量和幼患体重均显著高于POI组(P0.05)。结论来源于经血的MenSCs 及其培养液可有效改善 POI 小鼠的卵巢功能,并可提升其生育能力。【关键词】早发性卵巢功能不全；经血；间充质干细胞；生育能力【中图分类号】R711.75Therapeutic effect of menstrual blood-derived mesenchymal stem cells and their culture medium on prematureovarian insufficiency in miceYU Ke-da,MAOJia-ting,CHAI Juan,BAOYun,SHI Shuai*Center of Reproductive Medicine,Jinhua Peoples Hospital,JinhuaObjective:To investigate the therapeutic effect of menstrual blood-derived mesenchymal stem cells(MenSCs）a n d t h e ir c u lt u r e m e d iu m （M e n SC s-C M）o n c h e m o t h e r a p y-in d u c e d p r e m a t u r e o v a r ia ninsufficiency(POI)in mice.Methods:Healthy female ICR mice were divided into four groups:control group,POI group,POI+MenSCs group and POI+MenSCs-CM group.The POI mouse model was established by usingcyclophosphamide(CTX)in the POI group,POI+MenSCs group and POI+MenSCs-CM group,and thecorresponding treatment was performed after successful modeling.The ovarian organ coefficient of micewas measured.The ovarian follicles were examined by HE staining.The levels of serum FSH and estrogen(E,)were determined by ELISA.The apoptosis of ovarian cells was observed by TUNEL method,and thefertility was detected by mating experiment.The results of four experimental groups were compared.【收稿日期】2023-03-30；【修回日期】2 0 2 3-0 6-0 9【基金项目】浙江省医药卫生科技计划项目（2 0 2 2 KY1333）；金华市科学技术研究计划项目（2 0 19-4-0 2 6）【作者简介】余柯达，男，浙江余姚人，硕士，助理研究员，生物学专业，（*通讯作者，Email：s h u a i 518 918 16 3.c o m）【文献标识码】A【A b s t r a c t 321000生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期Results:On the 7th and 14th day of treatment,the ovarian organ coefficients of the POI group weresignificantly lower than that of the control group(P0.05),and that of POI+MenSCs group and POI+MenSCs-CM group were significantly higher than that of the POI group(all P0.05).On the 7th and 14thday of treatment,the serum FSH level in the POI group was significantly higher than that in the controlgroup(P0.05),and the serum FSH level in the POI+MenSCs group and POI+MenSCs-CM group wassignificantly lower than that in the POI group(all P0.05).On the 14th day of treatment,the serum E2level in the POI+MenSCs group and POI+MenSCs-CM group was significantly higher than that in thePOI group(all P0.05).The number of primordial follicles,primary follicles,secondary follicles andantral follicles in the POI+MenSCs group and POI+MenSCs-CM group was significantly higher than thatin the POI group(all P0.05),and the number of atresia follicles was significantly lower than that in thePOI group(all P0.05).The results of TUNEL method showed that the majority of apoptotic cells weregranulosa cells(GCs)around and inside mature follicles.The apoptosis index of the POI+MenSCs groupand POI+MenSCs-CM group was significantly lower than that of the POI group(all P0.05),and thelitter size and pup weight of both groups were significantly higher than those of the POI group(all P0.05).Conclusions:MenSCs derived from menstrual blood and their culture medium can effectively improvethe ovarian function of POI and improve its fertility.Key words:Premature ovarian insufficiency;Menstrual blood;Mesenchymal stem cells;Fertility早发性卵巢功能不全(POI)是一种常见内分泌疾病,会导致女性不孕,其具有病因复杂及临床异质性高等特点。POI临床表现为女性在40 岁之前发生闭经,血清卵泡刺激素（FSH)升高、雌激素（E）下降。POI的病因目前尚不完全明确，与遗传缺陷、自身免疫和化疗损伤等诱因有关。近年来育龄女性癌症的发病率逐年上升，化疗暴露成为了POI 的重要诱因 2 。环磷酰胺(CTX)是临床常用于恶性肿瘤治疗的烷化剂，会损伤女性的生殖系统，导致POI的发生 3。目前对POI的治疗手段极为有限，临床上以激素替代疗法（HRT)为主，但无法恢复患者的卵巢功能和生育能力 4。因此如何安全有效地改善POI患者的卵巢功能、恢复其生育能力是目前临床上急需解决的重要问题。近年来，研究发现间充质干细胞（MSCs)移植可有效改善POI模型动物的卵巢功能及生育能力 5-9，成为了生殖内分泌研究领域的热点。有研究者从经血中新发现了一种 MSCs一一经血间充质干细胞（MenSCs)10-11。相较于其他 MSCs,MenSCs具有取材易、来源广、含量多等优点，且来源于人体废弃物，无伦理问题，具有广阔的基础研究和临床应用潜力 12 。本研究探讨了MenSCs及其培养液(MenSCs-CM)对 CTX诱导的 POI 小鼠模型卵巢功:1545(JReprodMed2023,32(10):1544-1550)能的修复作用,为临床POI的治疗提供新的方法。资料和方法一、研究对象1.实验动物与细胞：健康ICR雌性小鼠，6 周龄，SPF级，体质量约2 7 g，购自杭州子源实验动物科技有限公司生产许可证号：SCXK（浙）2 0 19-0004，在恒温恒湿环境下饲养，提供12 h光照/12h黑暗环境，正常昼夜节律自由饮食。所有实验操作经医院实验动物管理与使用委员会核准通过。MenSCs原代细胞由本实验室从女性志愿者经血中分离培养得到 13。2主要试剂和仪器：CTX（Si g m a，美国）；卵泡刺激素（FSH)ELISA试剂盒（上海江莱生物），雌二醇（E,）EL I SA 试剂盒（上海江莱生物）；苏木精（Si g m a，美国），伊红（Sigma，美国）；TUNEL检测试剂盒（Roche，美国）。全波长酶标仪（MD，美国）；低速自动平衡离心机（湖南湘仪）；轮转式切片机（L EI CA，德国）；病理组织漂烘仪（常州市郝思琳）；显微镜（OLYMPUS，日本）；隔水式恒温培养箱（上海跃进）。二、研究方法1.MenSCs/MenSCs-CM制备 13:选择生长状.1546：态最好的第4代MenSCs,用无血清培养基（Gibco，美国)培养3d（37，5%CO 2），收集培养基，此时的培养基即为 MenSCs-CM。贴壁的 MenSCs 用胰蛋白酶(Gibco，美国)消化，无血清培养基洗涤后制成浓度为1X10/ml单细胞悬液，即MenSCs。2.分组及治疗:ICR雌性小鼠经阴道脱落细胞涂片检查确定小鼠动情周期正常后，随机分为4组：对照组（n=30）、PO I 组（n=30）、PO I+M e n SC s 组(n=30）和 POI+MenSCs-CM 组（n=30）。PO I组、POI+MenSCs 组和 POI+MenSCs-CM组给予CTX 50 mg/kg/d 腹腔注射，连续注射 15 d,构建POI模型14,对照组腹腔注射同体积的生理盐水。在POI模型建立的第 7 天对POI十MenSCs组和POI十MenSCs-CM组小鼠分别尾静脉注入 0.6 ml的 MenSCs或 MenSCs-CM 治疗,对照组和 POI 组小鼠注射相等体积的无血清培养基，尾静脉注射后第3天再注射1次。分别于治疗后第7 天和第14天进行取材检测。3.取材：所有小鼠在取材前两天进行孕马血清促性腺激素(PMSG,苏州苏牧)注射，使各组的动情周期一致。小鼠处死前，称取其体重，摘眼球取血，分离血清。处死小鼠后从卵囊内取出卵巢，称取两侧卵巢重量,计算卵巢脏器系数,卵巢脏器系数=卵巢重量/体重X100%。4.血清 FSH、E,测定:用 ELISA法测定血清 FSH、E，的含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。5.HE染色观察卵巢形态：小鼠卵巢在4%多聚甲醛中固定过夜，脱水后用石蜡包埋，行常规HE染色，在显微镜下观察卵巢组织和卵泡形态，计数各级卵泡(原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦状卵泡和闭锁卵泡)15 。A0.25%/豫当器班薰响0.200.150.100.050A:小鼠的卵巢脏器系数;B:血清FSH水平;C:血清E2水平。7 d和14d分别代表治疗7、14d后；组间相互比较，*P0.05。生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期6T U NEL 法检测卵巢组织中细胞调亡:应用试剂盒观察卵巢组织中细胞调亡情况，阳性细胞的细胞核为棕黄色或棕褐色染色，计算卵巢组织细胞凋亡指数,凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数X100%。7小鼠生育能力的观察：在治疗后第7 天将雌鼠与证实可育的雄鼠按1：1进行合笼饲养10 d,观察小鼠的怀孕和幼崽情况，记录每窝小鼠的产仔数，并称取幼出生时的体重。三、统计学分析采用SPSS16.0统计软件进行数据分析。数据均以均数土标准差(土s)表示，采用方差分析比较4组间差异。P0.05为差异有统计学意义。结果一、各组小鼠卵巢脏器系数和血清性激素检测结果治疗第7 天,POI 组的卵巢脏器系数显著低于对照组(P0.05),POI+MenSCs 组和 POI+MenSCs-CM 组均显著高于POI组（P0.05)；治疗第14天,各组的卵巢脏器系数变化趋势与治疗第7 天一致（图1A)。治疗第7 天和第14天,POI组的血清FSH水平显著高于对照组（P0.05）,PO I 十MenSCs组和 POI十MenSCs-CM组均显著低于 POI 组(P0.05),POI+MenSCs 组显著低于 POIM e n SC s-C M 组（P0.05,图1B)。治疗第7 天,POI组的血清E水平显著低于对照组（P0.05)；治疗第14天,POI十MenSCs组和POI十MenSCs-CM组的血清E2水平均显著高于POI 组(P0.05）,PO I+Me n SC s 组显著高于 POI+MenSCs-CM 组(P0.05,图 1C)。B对照组POI组POI+MenSCs组POI+MenSCs-CM组*7d对照组POI组POI+MenSCs组POI+MenSCs-CM组*30*25*(T/n)/HSH*14d图1各组小鼠的卵巢脏器系数、血清FSH和 E结果C1412*(1/oud)/20F15105工07d对照组POI组POI+MenSCs组POI+MenSCs-CM组*工*108642014 d7d14d生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期二、各组小鼠卵巢组织形态学观察和卵泡计数结果HE染色结果显示，对照组卵巢结构完整，可见正常发育、结构整齐、大小不一的各级卵泡;POI组卵泡数量较对照组明显减少，且大部分发育不良，可见闭锁卵泡;POI+MenSCs 组和 POI+MenSCs-CM 组的卵巢组织较POI组各级卵泡数量增加，闭锁卵泡明显减少（图2）。卵巢组织卵泡计数结果显示，治疗第7 天和第对照组1547.14天,POI组的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡的数量均显著少于对照组（P0.05）,闭锁卵泡数显著多于对照组（P0.05);POI十MenSCs组和POI+MenSCs-CM组的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡数量均显著多于POI组(（P0.05),闭锁卵泡数显著少于POI组（P0.05）;PO I+M e n SC s组的初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡数量均显著多于POI+MenSCs-CM组（P0.05）,闭锁卵泡数显著少于POI+MenSCs-CM组(P0.05)(图3)。POI组POI+MenSCs组POI+MenSCs-CM组7d50um14dum图2 各组小鼠卵巢组织形态学观察（HE染色，bar=250m）A对照组POI组POI+MenSCs组POI+MenSCs-CM组250*200*150100500原始卵泡初级卵泡次级卵泡窦状卵泡闭锁卵泡A：治疗7 d后;B:治疗14d后。组间相互比较，*P0.05。图3各组小鼠卵巢组织中各级卵泡计数三、各组小鼠卵巢组织细胞凋亡水平比较(P0.05)(图 5)。卵巢组织细胞亡结果显示，调亡细胞大部分四、各组小鼠生育能力比较为成熟卵泡周边及内部的颗粒细胞（GCs）（图4）。小鼠交配实验结果显示，POI组的幼患数显治疗第7 天和第14天,POI组的调亡指数显著高于著少于对照组（P0.05），PO I 十MenSCs 组和对照组（P0.05），PO I 十MenSCs 组和 POI十POI十MenSCs-CM 组均显著多于 POI 组（PMenSCs-CM组均显著低于POI组（均P0.05）,0.05）。各组小鼠的幼体重变化趋势与幼患数一POI+MenSCs 组显著低于 POI+MenSCs-CM 组致(图6)。250B对照组POI组POI+MenSCs组POI+MenSCs-CM组250*200水水150*100500原始卵泡初级卵泡次级卵泡窦状卵泡闭锁卵泡1548生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期对照组POI组POI+MenSCs组POI+MenSCs-CM组7dm14d红色箭头指示凋亡细胞。图4各组小鼠卵巢组织细胞凋亡结果（TUNEL染色，bar=25m)对照组POI组POI+MenSCs组POI+MenSCs-CM组25*20*%/工1510507d和14d分别代表治疗7、14d后；组间相互比较，*P0.05。图5各组小鼠卵巢组织细胞调亡指数A对照组POI组POI+MenSCs组POI+MenSCs-CM组12*1086420讨论MSCs作为一种成体干细胞，具有强大的增殖和自我更新能力，其广泛存在于骨髓、脂肪和脐带等组织中 16 。MSCs移植治疗为组织修复和功能重7d*A：产仔数量统计图；B：幼患体重统计图。组间相互比较，P0.05。图6 各组小鼠产仔数量和幼患体重情况建开拓了新的方向。2 0 0 7 年有研究者首次从女性经血中分离得到并鉴定了MenSCsl11。M e n SCs来源于女性经血,经血是一种人体废弃物,没有伦理上的相关问题，且意味着可以不断地从同一个女性志愿者的经血中获得具有相同遗传背景的MenSCs,14dB4.03.53.03/重闻格2.52.01.51.00.50对照组POI组POI+MenSCs组POI+MenSCs-CM组*生殖医学杂志2 0 2 3年10 月第32 卷第10 期为其理论基础研究和临床应用转化提供了极大的便利。本研究所用从经血中分离得到的MenSCs，具有MSCs典型的形态、细胞表面标志物和生物学特性 13。MSCs具有自我更新、可塑性强、低免疫原性等特点，在组织功能重建，机体损伤修复和免疫调节等方面具有重要应用价值，是现代生物医学领域中的热点之 17-18 。本研究结果发现MenSCs尾静脉注射治疗化疗所致POI模型小鼠后,卵巢脏器系数增加，血清FSH和E2水平恢复，GCs调亡显著减少，生育能力（产仔数和幼崽体重)得到提高，使POI模型小鼠的卵巢结构和功能损伤得到修复。与骨髓间充质干细胞(BMSCs)5、羊膜间充质干细胞（AMSCs)7、绒毛膜间充质干细胞（CPMSCs)8I和脐带间充质干细胞(UCMSCs)9等MSCs对化疗所致 POI治疗方面具有一致的效果。表明MSCs移植可改变局部组织反应及其内分泌激素的分泌，改善激素水平，促进卵泡发育，抑制卵巢过多卵泡闭锁和GCs调亡，提高卵巢储备能力，从而修复卵巢功能。但由于移植MSCs治疗化疗所致POI具有恶变和医源性感染的风险，以及免疫排斥和稳定安全性等问题，严重限制了其在POI治疗上的进一步发展。关于目前MSCs治疗POI 的主要机制，多数研究认为是其通过旁分泌作用来修复、调节、治疗卵巢功能。有研究表明 BMSCs19 UCMSCs9和 AMSCs20尾静脉注射POI模型鼠后卵巢功能得以恢复，均未观察到MSCs向卵巢细胞分化,更多的是通过旁分泌途径来抑制GCs调亡，改善卵巢局部微环境，进而恢复卵巢功能。本研究将 MenSCs-CM 通过尾静脉注射 POI模型小鼠，发现其与 MenSCs有一致的治疗效果，对血清性激素水平（FSH、E,）恢复和GCs调亡的改善作用稍差于MenSCs，但对生育能力（产仔数和幼患体重）的提升作用与MenSCs无显著差异性。MSCs在培养过程中会分泌细胞因子和胞外囊泡(EVs)。M SC s 分泌的细胞因子，例如血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1)和肝细胞生长因子（HGF),在恢复卵巢功能中起重要作用 2 1。Li等 8 研究认为MSCs 对 POI卵巢的修复作用，是通过其分泌的多种细胞因子组合共同发挥作用,而非单个细胞因子。目前研究表明细胞因子无法充分表现MSCs的功效 2 2 ,EVs是旁分泌机制中的重要组成部分，主要由外泌体和微囊泡组成，:1549.携带具有生物活性的蛋白质、mRNAs 和 microRNAs(miRNAs)等,参与细胞间的通讯和信号传导，在组织再生中发挥着重要的作用2 3-2 41。体外和体内研究均表明MSCs分泌的EVs可有效抑制GCs的调亡，目前已有研究表明MSCs分泌的EVs携带的miR-144-5p、m i R-2 3a、m i R-2 7 a、m i R-17-5P和 miR-320可调控不同通路来抑制GCs的调亡，恢复POI卵巢功能 2 5-2 8 。上述研究表明MSCs分泌的EVs通过自身携带的物质可以起到与MSCs类似甚至同样的治疗效果。我们的实验仍存在一定的局限性。本研究仅初步探讨了MenSCs及其培养液对化疗所致POI模型小鼠卵巢功能和生育能力的改善作用，并未对MenSCs治疗POI的具体有效分泌产物和分子机制进行探究。因此，接下来MenSCs 治疗POI 的研究，我们将从MenSCs分泌的EVs 以及对卵巢功能相关关键通路进行更深入的研究。【参考 文献】1 Fu YX,Ji J,Shan F,et al.Human mesenchymal stem celltreatment of premature ovarian failure:new challenges andopportunitiesJJ.Stem Cell Res Ther,2021,12:161.2 Lee SJ,Schover LR,Partridge AH,et al.American Society ofClinical Oncology recommendations on fertility preservation incancer patientsJJ.J Clin Oncol,2006,24:2917-2931.3Fleischer RT,Vollenhoven BJ,Weston GC.The effects ofchemotherapy and radiotherapy on fertility in premenopausalwomenJJ.Obstet Gynecol Surv,201l,66:248-254.4 Lee HJ,Selesniemi K,Nikura Y,et al.Bone marrowtransplantation generates immature oocytes and rescues long-term fertility in a preclinical mouse model of chemotherapy-induced premature ovarian failureJ.J Clin Oncol,2007,25:3198-3204.5 BadawyA,Sobh MA,Ahdy M,et al.Bone marrowmesenchymal stem cell repair of 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