辣木叶多糖对小鼠溃疡性结肠炎的防治与机制研究.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1659-1668辣木叶多糖对小鼠溃疡性结肠炎的防治与机制研究en-2.3,，彭伟龙1-2，刘明江-，伯若楠，李金贵1-2Hosameldeen Mohamed Husien扬州大学兽医学院；江苏省高校动物重要疫病与人畜共患病防控协同中心,扬州2 2 50 0 9；3布尔塔那大学兽医学院,Rufaa999129摘要：探讨辣木叶多糖（Moringa oleifera leaf polysaccharide,MOLP）对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC)防治作用及其作用机制。50 只BALB/c小鼠随机分为正常对照组（Con组）、模型对照组（D SS组）、MOLP-L(25mg/kg）、M O LF-M(50 mg/k g）、M O LF-H(10 0 mg/k g）组，通过饮用4%DSS诱导小鼠UC模型。试验期间每日记录各组小鼠体重情况和疾病活动指数(DAI)变化;ELISA法检测血清中TNF-、IL-1、IL-10、H M CB1和结肠组织MPO含量;HE染色观察结肠组织病理学变化;实时荧光定量PCR法检测结肠组织TNF-、IL-1、IL-10、HMCB1mRNA表达水平；蛋白免疫印迹（Westernblot）法检测结肠组织中TLR4、M y D 8 8、P6 5、p-P6 5、Ik B和p-IkB的表达;16 S rRNA高通量测序探究小鼠肠道菌群的变化。结果显示,与Con组相比,DSS组小鼠一般状况下降,体重减轻,结肠长度缩短,DAI和病理切片损伤评分均显著增加(P0.001);TNF-、IL-1、H M G B1含量和MPO活性显著升高(P0.001),结肠组织中TLR4、M y D 8 8、p-P6 5和p-IkB的蛋白表达水平显著上调（P0.001）。与DSS组相比,不同剂量MOLP处理组明显改善上述病变和炎性指标,显著提升了IL-10的表达,作用结果具有剂量依赖性;并且MOLP可以改善UC小鼠肠道菌群多样性，恢复菌群平衡。研究结果提示MOLP可以通过抑制炎症反应，调节小鼠肠道菌群多样性、组成和相对丰度进而发挥防治UC 的作用。关键词：辣木叶多糖；溃疡性结肠炎；炎性因子;肠道菌群中图分类号：S859.7D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.10.002Protective effects and mechanism of Moringa oleiferaleaf polysaccharide on ulcerative colitis in miceHosaelden Mohamed Husie-,PENG ei-ong-,LU Ming jag*,9:1,2BO Ruo-nan-2,LI Jin-gui.1i1,2*College of Veterinary Medicine,Yangzhou University;JiangsuCo-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases andZoonoses,Yangzhou 225009,China;College of Veterinary Medicine,Albutana University,Rufaa 999129,SudanAbstract:The aim of this study was to investigate the preventive and therapeutic effects of Moringa oleifera leaf polysaccha-ride(MOLP)on ulcerative colitis(UC)in mice induced by dextran sodium sulfate(DSS).50 BALB/c mice were randomlydivided into normal Con group,DSS group,MOLP-L(25 mg/kg)group,MOLF-M(50 mg/kg)group,and MOLF-H(100 mg/kg)group.Mice were induced UC by drinking 4%DSS.During the experiment,the general condition and body weight of micewere recorded daily,and the changes in disease activity index(DAI)were observed;ELISA was used to measure the contentsof TNF-,IL-1,IL-10,HMGB1 in serum and MPO in colon tissue;HE staining was used to observe the pathological morpho-logical damage of colon tissues;qPCR was used to detect TNF-,IL-1,IL-10 and HMGB1 mRNA expression levels in colontissues;Western blot was used to measure TLR4,MyD88,P65,p-P65,IkB and p-IkB expression in colon tissues;16SrRNA was showed the changes of intestinal microflora in mice.Compared with the Con group,mice in the DSS group had de-creased general condition,weight loss,colon length was shortened,DAI and pathological section damage scores were signifi-收稿日期:2 0 2 3-0 4-17基金项目：国家自然科学基金（32 0 7 2 911）；江苏省高校优势学科建设工程项目（PAPD2018)十共同第一作者*通信作者 Tel:86-018352762175;E-mail:jgli 文献标识码：A接受日期：2 0 2 3-0 8-2 5文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)10-16 59-101660cantly increased(P0.001),TNF-,IL-1,HMGB1 content and MPO activity were significantly increased(P0.001),TLR4,MyD88,colon tissue.The protein expression levels of p-P65 and p-IkBa were significantly upregulated(P0.001);Compared with the DSS group,the condition of mice in the different doses of MOLP treatment group was significantly im-proved,and significantly increased IL-10 expression,the results were dose-dependent.MOLP also could regulate the gut mi-crobiota diversity significantly and restore the balance of intestinal bacteria.The results indicated that MOLP might inhibit in-flammatory response and regulate the diversity,composition and relative abundance of gut microbiota in mice,which couldplay a positive role in preventing and treating UC.Key words:Moringa oleifera leaf polysaccharide;ulcerative colitis;inflammatory factor;intestinal flora溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种病因极其复杂的非特异性、复发性结肠炎症疾病,常导致患者结肠黏膜溃疡和溃烂，出现频繁的腹痛、腹泻、便血等一系列临床症状 ,因其反复发作,迁延难愈,严重影响了患者的正常生活,并且还会增加病人继发感染和患结肠癌的风险。Eric 等2 研究表明,UC发病机制与肠屏障功能的受损和肠道微环境的改变密切相关。当肠黏膜屏障受损时,肠道固有层中的免疫细胞暴露在外界抗原和病原体中,激活的免疫细胞在机体内产生炎症级联反应，引起T细胞亚群介导非特异性 Th2 免疫反应3,同时TLR4与衔接蛋白MyD88进行信号传导,导致NF-kB的激活,促进白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-（T NF-)等促炎因子的表达4,破坏肠道免疫稳态，进一步损伤肠腔上皮细胞。同时,肠道菌群的组成对免疫系统发育和功能具有重要影响5,当肠道内有益菌群和致病菌群数量比例失调时,导致毒素、肠腔细菌和抗原进入机体,加剧UC 患者肠黏膜炎症和过度的氧化应激反应6 。这提示针对炎性因子和肠道菌群进行干预是防治UC 的有效靶点。辣木（Moringa oleifera），原产于印度,其广泛种植于非洲、亚洲的热带和亚热带地区7 ，近年来大面积种植于我国的云南广西地区，于2 0 12 年被中国卫生部批准认定为新资源食品，也是我国重要的药食两用的食品资源。辣木叶的营养价值极高，长期服用辣木叶食品可以提高人体免疫力，同时具有一定疾病预防的作用8 。其主要的生物活性成分为多酚、黄酮和多糖类物质,并发挥着显著的抗炎9、抗氧化和抗肿瘤作用。目前国内外对辣木叶多糖（M o r i n g a o l e i f e r a l e a f p o l y s a c c h a r i d e,M O LP）的相关报道较少,还局限于传统提取工艺的优化和化学组成分析,关于MOLP对肠炎的防治效果尚不明确。因此,本试验采用DSS诱导建立UC小鼠模型,观察MOLP对急性结肠炎小鼠体内炎症反应和肠道菌群的改善效果,旨在明确MOLP对UC防治作用机制，天然产物研究与开发以期为 MOLP 的药理学研究和临床疾病治疗提供思路。1材料与方法1.1实验动物体重为（2 0 2）g的SPF级雄性BALB/c小鼠50只，购于扬州大学比较医学中心，实验动物生产许可证号为SCXK苏2 0 17-0 0 0 9,实验动物使用许可证号为SYXK苏】2 0 17-0 0 44，合格证编号为NO.202206249，动物饲养于SPF级动物饲养室，饲养环境温度为（2 42），相对湿度为（6 0 10）%,12h明暗循环。试验过程中小鼠均饲喂商品鼠粮，自由采食与饮水，实验程序符合扬州大学兽医学院实验动物伦理委员会的批准（编号YZUDWLL-202206-008）。1.2至药物与试剂辣木叶（云南孺子牛生物科技有限公司,LotNO:210523);DSS(MW:36 000-50 000,美国 MP Bi-omedicals公司,LotNO:S6132）;H E染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司,CatNO:G1120）;RNA-e a s yisolation Reagent HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+g D NA w i p e r)（Lo t NO:11141ES6 0）和 ChamQTMSYBRqPCRMasterMix（南京诺唯赞生物科技有限公司,LotNO:11201ES08）；透析袋（上海源叶生物科技有限公司，CatNO：SP132 594）髓过氧化物酶（M PO)试剂盒（南京建成生物工程研究所,Cat NO：A044-1-1);IL-1（Ca t NO:c k-E2 0 17 4)、I L-10（Ca tNO:ck-E20162）、T NF-（Ca t NO:c k-E2 0 8 52）、HMGB1（Ca t NO:c k-E2 0 318）ELI SA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；抗体TLR4（14358 s）、M y D 8 8（42 8 3s）、P-Ik B（2 8 59s）、Ik B（48 12 s）、P-p 6 5(3033s）、p 6 5(8 2 42 s）-actin(4970s)（Ce l l Si g n a l i n gTechnology公司）；FITC标记羊抗兔（A0562）和Cy3标记的山羊抗兔二抗（A0516）（北京碧云天生物技术有限公司）。1.3主要仪器RM2125RTS石蜡切片机（Leica公司）；DM正Vol.35Vol.35置荧光显微镜（Leica公司）；荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）；恒温金属浴（卡尤迪生物科技有限公司）;ChemiScope化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；超纯水系统（MerckMillipore公司）;Epoch酶标仪（Biotak公司）。1.4方法1.4.11MOLP的制备辣木叶按照Sharma等10 研究报道的方法,将新鲜辣木叶超微粉碎后，在7 0 条件下加去离子水以1：10 的比例提取辣木叶粗多糖三次，每次90min,经40 0 0 r/min离心2 0 min,将上清液合并后经旋转蒸发仪减压浓缩至50 mL。随后用30 0 mL95%乙醇沉淀多糖,并在4条件下静置过夜,将沉淀复溶于去离子水中，装人透析袋（截止分子量3500 Da)中4透析2 d后使用Sevage法（Sevage试剂：多糖水溶液=1:4)除去蛋白,重复萃取10 次直至三酮反应为阴性,最后冷冻干燥得到MOLP。经苯酚-硫酸法测得糖含量为6 4.8%。分数Score01234Hosameldeen Mohamed Husien等：辣木叶多糖对小鼠溃疡性结肠炎的防治与机制研究动物分组、造模及给药50只小鼠预饲养3d后,称重并随机分成正常对照组（Con组）、模型对照组（DSS组）、MOLP25mg/kg、50 mg/k g、10 0 mg/k g 组(MOLP-L、M O LP-M、MOLP-H组）。除Con组饮用蒸馏水外,其余各组均饮用4%DSS（W/V)溶液7 d,建立小鼠UC模型。药物处理组自造模第一天开始给予相应药液进行灌胃,每只0.2 mL/d,连续给药7 d。1.4.3小鼠一般状况及疾病活动指数(DAI)评分每天观察记录小鼠的体质量、粪便隐血情况和粪便状态等一般状况,参照Coope 等1 介绍的方法进行DAI评分,详细DAI评分细则见表1,计算公式为:DAI=（体质量下降率+粪便性状得分+粪便隐血得分）/3，体质量下降率=（每日体质量-初始体质量)/初始体质量10 0%；使用联苯胺冰醋酸法检测粪便是否隐血或带血，当DAI评分达到0.5分以上时表示小鼠UC模型造模成功。表1疾病活动指数评分标准Table 1 The criterion for judgement of disease activity index粪便性状Stool trait正常粪便软便但成形粪便呈糊状但肛门无粘附膏状粪便,肛门有粘附腹泻,水样便16611.4.2粪便隐血情况Stool bleeding隐血试验阴性隐血试验弱阳性隐血试验阳性隐血试验强阳性肛门四周带血体质量下降率Weight loss0%1%5%6%10%11%20%20%以上1.4.4样本采集试验结束后,将小鼠通过异氟烷进行麻醉,从小鼠眼眶静脉丛采集血液于1.5mL EP管中,30 0 0 r/min离心10 min,吸取血清冷贮,用于后续ELISA试验。待完全麻醉后用脱颈椎的方式处死小鼠,剖开腹腔,剪取距肛门1 cm 处带有回盲瓣的结肠,拍照观察结肠长度;剪取距肛门1cm处结肠组织约2cm于4%多聚甲醛中固定,用于后续HE染色和免疫荧光试验;取 Con、D SS、M O LP-H 组小鼠结肠内的粪便至冻存管中,待提取粪便中细菌的DNA,以供肠道菌群检测；剩余各组结肠组织置于冻存管中,液氮保存,用于后续qPCR以及蛋白相关检测试验。1.4.5HE染色观察结肠组织病理学变化及病理损伤评分取4%多聚甲醛溶液中固定的结肠组织经脱水处理、透明、石蜡包埋、修蜡及切片等步骤经HE染色后置于显微镜下观察结肠组织病理形态学变化并拍照,参照Cai 等12 方法进行病理损伤评分,标准如下：(1)炎症严重程度：0 分=无;1分=轻度;2 分=中度;3分=重度。（2)损伤深度计分:0 分=无；1分=黏膜；2 分=黏膜及黏膜下层；3分=全层。(3)隐窝损伤评分:0 分=无;1分=1/3基底部隐窝破坏;2 分=2/3基底部隐窝破坏;3分=隐窝消失但上皮存在;4分=隐窝及上皮全部破坏。1.4.6血清中炎性因子的检测以及结肠组织中MPO含量测定采用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中TNF-、IL-1、IL-10 和HMGB1的含量，使用MPO试剂盒检测各组小鼠结肠组织中MPO含量。16621.4.7结肠组织中炎性因子的mRNA表达水平取冻存的小鼠结肠组织10 0 mg于EP管中,按照RNA提取试剂盒说明书的方法提取RNA，然后将其反转录成cDNA后,进行荧光定量PCR扩增，引物序列见表2。按照荧光定量试剂盒说明书预混目的基因Target gene-actinIL-1TNF-IL-10HMGB1天然产物研究与开发20L反应体系,反应程序:95 2 min预变性;95变性10 s,58反应30 s,进行40 个循环；然后95反应15 s,60反应1min,95反应15 s。该实验用-actin 为内参基因,采用 2-ACi法对 Ct 值进行相对定量分析。表2 qPCR引物序列Table 2 qPCR primer sequence引物序列Primer sequence(5-3)F:TGCTGTCCCTGTATGCCTCTR:TTTGATGTCACGCACGATTTF:AGTTGACGGACCCCAAAAGATR:GTTGATGTGCTGCTGCGAGAF:GGTCCCAACAAGGAGGAGAAR:CTCCTCTGCTTGGTGGTTTGF:CTCTTACTGACTGGCATGAGGATR:GAGTCGGTTAGCAGTATGTTGTF:GCATCCTGGCTTATCCATTGGR:GGCTGCTTGTCATCTGCTGVol.35产物长度Product length(bp)224100141176631.4.8Westernblot法检测结肠组织NF-kB信号通路相关蛋白表达情况将10 0 mg冻存的结肠组织剪碎研磨后加人RI-PA裂解液充分裂解,离心收集上清液，进行BCA蛋白浓度测定,然后将蛋白稀释至相同浓度后置于沸水中煮沸10 min使蛋白变性。每个样品取10 L进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转至PVDF膜后使用5%脱脂奶封闭2 h,随后分别使用TLR4、M y D 8 8、P-IkB、Ik B、P-p 6 5、p 6 5、-actin抗体（稀释比例均为1:1000)4孵育过夜。次日加人二抗（稀释比例为1:50 0 0)室温孵育2 h,经TBST洗膜三次后使用ECL显影仪检测蛋白表达情况。以-actin 为内参，利用ImageJ软件分析蛋白灰度值。1.4.9鼠粪便中细菌DNA的提取及测序采用CTAB方法对各组小鼠结肠内容物样本的基因组 DNA 进行提取,利用 1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测DNA提取纯度和浓度，随后根据测序区域的选择,针对16 S rRNA基因V4-V5可变区合成特异性引物并对引物进行PCR扩增。PCR扩增产物检测合格后,对目的条带使用Qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物，然后进行文库构建。构建好的文库经过Qubit 和qPCR定量,文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。1.4.10数据统计学分析采用 GraphPad Prisms one-way ANOVA 检测进行统计分析,试验结果均用平均值标准误表示,P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1MMOLP对UC小鼠一般状况以及DAI评分的影响Con组小鼠的饮食和状态正常,体重稳定增长，粪便呈麦粒状,DAI 评分为 O。D SS 组小鼠在第34d开始出现被毛粗乱、精神状态变差、体重下降、粪便黏稠并且出现轻微糊肛现象;第57 d粪便带血严重、肛门处粪便黏连、畏寒、体重下降,结肠长度和DAI评分与Con组相比显著升高（P0.001）。各用药组腹泻和血便情况明显减轻,精神状态得到改善,体重有不同程度的增长,MOLP-M与MOLP-H组结肠长度和 DAI评分与 DSS 组相比均显著降低(P0.001),详见表3。2.2MOLP对UC小鼠结肠组织病变及其形态结构图1A为小鼠结肠HE染色10 0 所显示图片，来观察小鼠结肠组织学改变情况。Con 组的小鼠肠腺结构正常,杯状细胞数量多,隐窝完整、排列有序；DSS组小鼠黏膜下层明显水肿（黑色箭头所示位置）,肠隐窝结构被破坏、变形、排序紊乱（所示位置）,黏膜层和黏膜下层有大量炎性细胞浸润，少数可达肌层（红色箭头所示位置）；各剂量MOLP组能够改善炎症引起的组织学改变，但MOLP-L和MOLP-M组小鼠的结肠仍可见多处炎性细胞浸润，隐窝结构被破坏,MOLP-H组改善效果最为明显,肠绒毛形态完整，腺体层次清晰可见，溃疡症状减轻。Vol.35Hosameldeen Mohamed Husien等：辣木叶多糖对小鼠溃疡性结肠炎的防治与机制研究1663表3各组小鼠平均体重变化率、疾病活动指数和结肠长度(xs,n=10)Table 3Average weight change rate,DAI and colon length of UC mice in each group(x s,n=10)组别GroupConDSSMOLF-LMOLF-MMOLF-H注:与Con组相比,*P0.05,*P0.01,Note:Compared with Con group,*p0.05,*p0.01,*p0.001;Compared with DS group,P0.05,#p0.01,#P0.001.Thesame below.病理损伤评分情况:与 Con 组相比,DSS 组小鼠结肠组织病理损伤评分显著升高（P0.001）;相比于DSS组,经MOLP处理后小鼠的结肠损伤状况得Con平均体重变化率Average rates ofweight change(%)116.15 1.4182.49 1.76*90.25 1.62#97.46 1.14#108.72 1.27#*P0.001;与DSS 组相比,#P0.05,#P0.01,#P0.001,下同。DSS疾病活动指数DAI03.50 0.22*2.50 0.22#2.33 0.21#1.67 0.33#到明显改善，MOLP-M和MOLP-H组小鼠结肠损伤评分显著降低(P0.001)。P结肠长度Colon length(cm)7.03 0.234.57 0.12*5.18 0.115.40 0.24#6.25 0.21#x001100umMOLP-M100mMOLP-H100mx001100m15-100um10-#5-#TdTOWW-dToNH-dTOW图1各组小鼠结肠组织病理学观察(xs,n=3)Fig.1 Histopathological observation of colon in mice of each group(x$,n=3)16642.3MOLP对UC 小鼠血清中炎性因子和结肠组织MPO含量的影响如表4 所示,与 Con 组相比,DSS 组小鼠血清中IL-1、T NF-、H M CB1和组织中MPO含量显著上升(P0.001）,IL-10 含量显著降低（P0.001);与表4各组小鼠血清中IL-1、T NF-、IL-10、H M CB1和结肠组织MPO水平（xs,n=10)Table 4SSerum levels of IL-1,TNF-,IL-10,HMGB1 and MPO in mice of each group(x s,n=10)组别IL-1Group(pg/mL)Con22.18 0.65DSS36.51 0.63*MOLF-L30.23 0.91#MOLF-M26.18 1.09#MOLF-H24.65 1.12#天然产物研究与开发DSS组相比,MOLP处理组炎性因子和MPO的含量得到改善，尤其是MOLP-H组小鼠血清中IL-1、TNF-、H M G B1和组织中MPO含量相比于DSS组均显著下降（P0.001）,IL-10 含量显著上升（P0.001)。TNF-IL-10(pg/mL)(pg/mL)74.59 1.76106.90 2.52117.8 4.52*84.08 1.71*99.73 3.32#90.04 2.1688.84 2.19#99.12 4.46#84.77 2.35#114.1 5.78#Vol.35HMGB1MPO(pg/mL)(U/g)25.05 1.820.11 0.0241.75 1.94*0.54 0.06*38.15 0.730.33 0.03#37.65 0.640.29 0.08#27.52 2.45#0.15 0.05#2.4MOLP对UC小鼠结肠组织炎性因子mRNA表达量的影响DSS 组小鼠结肠组织中促炎因子IL-1、T NF-、HMGB1的mRNA表达量与Con组相比均显著增加（P 0.0 0 1）,抗炎因子IL-10的mRNA表达量则显表5各组小鼠结肠组织IL-1、T NF-、IL-10、H M G B1mRNA 表达量（xs,n=10)Table 5 The mRNA expression levels of IL-1,TNF-,IL-10 and HMGB1 in colon tissue of mice in each group(x s,n=10)组别GroupConDSSMOLF-LMOLF-MMOLF-H著降低（P0.001）；使用MOLP干预后，IL-1、TNF-、H M G B1 的mRNA表达量明显降低,IL-10 的mRNA表达量也有升高,且随着MOLP剂量的增加，作用效果更显著,与DSS 组相比具有显著差异(P0.1,P0.01,P0.001)(见表5)。IL-1TNF-1.00 0.041.00 0.075.21 1.12*2.39 0.37*3.82 0.911.92 0.291.31 0.31#1.26 0.14#1.11 0.53#1.14 0.18#IL-101.00 0.060.31 0.09*0.51 0.120.8 0.11#1.29 0.17#HMGB11.00 0.074.36 0.91*2.51 0.532.07 0.81.27 0.51#2.5MOLP对UC小鼠结肠组织中NF-kB信号通路相关蛋白表达的影响与 Con 组相比较,DSS 组小鼠结肠组织中 P65和IkB的磷酸化增多并且p-P65/P65和p-IkB/IkB的比值显著增加(P0.001）,T LR4、M y D 8 8 蛋Table 6 Expression of TLR4,MyD88,p-P65/P65 and p-IkBo/IkB proteins in colon tissue of mice in each group(x s,n=10)组别GroupConDSSMOLF-LMOLF-MMOLF-H白表达量也显著上升（P0.001)（见表6);与DSS组相比较，MOLP-M和MOLP-H组均能明显下调TLR4、M y D 8 8 蛋白的表达(P0.1,P0.001）,其中MOLP-H组还可以显著下调p-P65/P65和p-IkB/IkB蛋白的比值(P0.1)（见图2)。表6 各组小鼠TLR4、M y D 8 8、p-P6 5/P6 5和p-IkB/IkB蛋白表达量(x,n=10)TLR4/-actin0.82 0.031.41 0.05*1.23 0.041.15 0.08#0.98 0.03#MyD88/-actin1.61 0.132.48 0.07*2.47 0.062.27 0.08#1.66 0.06#p-P65/P650.47 0.020.72 0.05*0.67 0.060.55 0.040.51 0.04#p-IkB/IkB0.39 0.021.64 0.06*1.17 0.07#0.78 0.08#0.68 0.06#Vol.35Hosameldeen Mohamed Husien等：辣木叶多糖对小鼠溃疡性结肠炎的防治与机制研究1665TLR4MyD88P65p-P65IkBap-IkBa-actin图2各组小鼠结肠组织TLR4、M y D 8 8、P6 5、p-P65、I k B、p-I k B蛋白表达Fig.2Expression of TLR4,MyD88,P65,p-P65,IkB andp-IkB proteins in colon tissue of mice in each group2.6小鼠结肠粪便16 SrRNA测序及多样性分析稀释曲线可以直接反映测序数据量的合理性并反映样本中物种的丰富程度，当曲线趋于平坦时,说A00S4明测序数据量渐进合理（见图3A）。采用Venn图分析OTUs(operational taxonomic unit）数量及不同组之间共有或特有的 OTUs 数量,Con 组、DSS 组和MOLP组特有OTUs分别为935、2 96、430 个，总OTUs分别为310 9、2 6 2 8、2 7 14个,共有 OTUs为1526个,占总OTUs 的18.0 6%。与Con组相比,DSS组小鼠肠道菌群物种丰度降低,经MOLP处理后丰富度有所改善（见图3B）。以Observed species 和ConDSSMOLP-LMOLP-MMOLP-HShannon指数分析组间物种多样性差异是否显著，结果显示,DSS 组 Observed species 和 Shannon 指数与Con组相比显著降低（P0.05,P0.01）,经MOLP处理后则明显升高（P0.1,P0.001）（见图3C,3D)。选取在门（Phylum）水平上最大丰度排名前十的各组小鼠肠道菌群结构组成进行分析发现,DSS组弯曲菌门（Campylobacterota）相对丰度（10.49%）高于Con组（2.6 9%）,经MOLP处理后则明显降低BConDSS3489.5290152630045843010000C25002000-1500-20000Sequencenumber#30000序号400005000060000MOLPD9-8-7一#*1000-500-0E1(%）0.750.50.25465-4ConMOLPFOthersActinobacteriaChloroflexiAcidobacteresDelembacteresDesulfobaclerotaunidentifiedBacteriaCampylobacterotaProteobacteriaFimicutesBacteroidota10.7540.50.25-OthiersErysipelotrichalesClostidiaUCG-014PseudoshoradilespDesnlfobactecrotabesufovibnionalesRhizobialesLachnospiralesCanpylobacteralesBurkholderialesBacteroldalesMOLDSs1OL图3各组小鼠肠道菌群多样性分析(xs,n=10)Fig.3Diversity analysis of intestinal microflora of mice in each group(x s,n=10)1666（5.58%）；拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度经MOLP处理后（48.0 5%）比DSS组（51.7 9%）低且接近于Con组（44.9 4%）；而MOLP组厚壁菌门（Fi r m i c u t e s）相对丰度（2 5.58%）明显高于Con组（17.51%）和DSS组（16.49%）（见图3E）。在目（Order)水平分析各组小鼠的肠道菌群结构,拟杆菌目（Bacteroidales）的相对丰度最高,DSS组为50.7 6%,MOLP组与Con组接近,分别为46.39%和43.18%；弯曲菌目（Campylobacterales）的相对丰度在各组中占比趋势与拟杆菌目相似，经MOLP处理后（5.8 5%）相比于DSS组有所降低（10.49%），接近于Con组（2.6 9%）；同时毛螺菌目（La c h n o s p i r a l e s）相对丰度（9.2 7%）明显高于Con组（4.58%）和DSS组（6.49%）（见图3F）。3讨论与结论近年来,UC 在全世界的发病率呈现逐年升高的趋势,相比于欧洲国家,中国的UC 发病率增长更快。现代医学在临床治疗过程中多用糖皮质激素、水杨酸制剂和免疫抑制剂来对UC进行干预治疗13,但停药后易复发和严重的药物副作用使其成为医学界棘手的问题。随着临床应用的不断深人，纯天然来源的植物多糖以其安全性、可及性、抗炎活性和高效的免疫增强功效受到关注14。辣木叶多糖作为辣木叶中有效活性成分之一,对它的功能活性研究主要集中在降血脂、降血糖、抗肿瘤和抗氧化15 等方面，为了探究MOLP对肠炎的防治作用，本试验应用DSS 建立 UC 模型并予以治疗。结果显示,造模后小鼠出现腹泻、血便、体重下降等症状，DAI评分升高，结肠长度变短等现象，提示造模成功,效果较为明显。经MOLP处理后可以显著改善UC小鼠的体重下降情况,降低DAI评分,减轻结肠黏膜受损和炎性浸润，下调小鼠血清和结肠中促炎因子IL-1、T NF-、H M G B1 的水平，上调抗炎因子IL-10 的水平,同时抑制 P65 和IkB 的磷酸化,防止TLR4/NF-kB信号通路的过度激活,维持肠道菌群稳态,通过抑制机体炎症反应和调节小鼠肠道菌群结构来发挥对UC 的防治作用。炎性细胞因子在UC 发生发展过程中是不可缺少的一部分,它由免疫细胞产生,通过免疫细胞间的相关作用,刺激抗原特异性效应细胞的增殖以及介导局部和全身炎症16 。正常情况下,巨噬细胞对炎天然产物研究与开发症信号应答较弱,在免疫抑制的细胞中较少促进其产生17 ,然而在UC发病期间,活化的巨噬细胞和树突状细胞分泌各种细胞因子如 TNF-、INF-、IL-1、I L-10 等用于调控炎症反应,这些细胞因子浓度的上调或者过度激活都会导致 T细胞失调和 Treg/Th1、T h 2、T h 17 失衡18 ,促进中性粒细胞在炎性部位的积累,减少上皮细胞中电解质的分泌,增加膜的通透性,进一步加剧炎症反应。用于治疗 UC 的药物和天然产物可有效的缓解炎性因子浓度和表达水平的失调,Xiao 等19 研究发现苦豆子总碱可通过调节UC小鼠体内促炎因子IL-1、IL-2 3、IL-17 水平，升高抗炎因子IL-10水平来缓解炎症。本研究通过对 UC 小鼠血清中 IL-1、T NF-、H M G B1 和 IL-10 的检测发现,MOLP可以明显抑制促炎因子的表达，上调抗炎因子的水平,同时通过实时荧光定量PCR技术对组织炎性因子的检测结果