菌酶协同发酵玉米蛋白粉制备高可溶性蛋白饲料的研究.pdf

NO.212023饲料研究FEEDRESEARCH47试验研究菌酶协同发酵玉米蛋白粉制备高可溶性蛋白饲料的研究樊磊刘晓兰1，2,3*郑喜群2.3（1.哈尔滨商业大学食品工程学院黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150 0 2 8；2.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，黑龙江齐齐哈尔16 10 0 6；3.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆16 3319）摘要：为了提高玉米蛋白粉的生物利用率，采用菌酶协同方法发酵玉米蛋白粉。试验筛选最优枯草芽孢杆菌和蛋白酶，通过单因素及响应面试验对发酵条件进行优化。结果确定了1株产蛋白酶较多且可特异性水解玉米蛋白粉的枯草芽孢杆菌A5作为发酵菌株，选择酸性蛋白酶进行酶解。最佳发酵条件为：酸性蛋白酶添加量100U/g、含水量4 5%、接种量5%、发酵温度35、发酵时间7 2 h。在此条件下，发酵饲料中可溶性蛋白含量为140.1mg/g，多肽含量为92.0 mg/g，总氨基酸含量为2 7.5%。与发酵前相比，发酵饲料中可溶性蛋白含量提高了94.2%，多肽含量提高了7 4.3%，总氨基酸含量提高了97.9%，DPPH自由基和ABTS+自由基清除率分别提高了32.8%和58.1%。结果表明，菌酶协同处理玉米蛋白粉可以有效提高玉米蛋白粉生物利用率，提升饲料营养价值。关键词：玉米蛋白粉；可溶性蛋白；多肽；发酵饲料中图分类号：S816文献标识码：A文章编号：10 0 2-2 8 13（2 0 2 3）2 1-0 0 4 7-0 7Doi:10.13557/ki.issn1002-2813.2023.21.010Study on preparation of high soluble protein feed withcorn gluten meal by co-fermented with bacteria and enzymeFANLeiLIU Xiao-lanZHENG Xi-qunAbstract:Solid-state fermentation of microorganism co-fermented with enzyme was conducted to improve thebioavailability of corn gluten meal.The experiment screened the optimal Bacillus subtilis and protease,and optimized thefermentation conditions through single factor and response interviews.Bacillus subtilis A5 with high hydrolysis ability ofcorn gluten meal was selected as the fermentation strain,and acid protease was used for enzymatic hydrolysis.The optimalfermentation condition was as follows:acid protease content 100 U/g,water content 45%,inoculum concentration 5%,fermentation temperature 35 C and fermentation time 72 h.Under the above conditions,the resulting contents of solubleprotein,peptides and total amino acid in fermented feed were 140.1 mg/g,92.0 mg/g and 27.5%,which were 94.2%,74.3%and 97.9%higher than unfermented feed,respectively.The DPPH and ABTS+radical scavenging rate in vitro were32.8%and 58.1%higher than the untreated ones,respectively.The study indicates that the synergistic treatment of cornprotein powder with bacteria and enzymes can effectively improve the bioavailability of corn protein powder and enhancethe nutritional value of feed.Key words:corn gluten meal;soluble protein content;peptides;fermented feed目前，我国饲料行业存在蛋白饲料短缺的问题。我国超过6 0%的饲料蛋白由豆提供，其次由玉米蛋白粉、第一作者：樊磊，硕士，研究方向为生物饲料。通信作者：刘晓兰，博士，教授，博士生导师。基金项目：中央支持地方高校改革发展资金高水平人才项目（项目编号：2 0 2 0 GSP08)；黑龙江省百千万工程科技重大专项（项目编号：2 0 2 0 ZX06B01）；黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室开放课题（项目编号：SPKF202015）；黑龙江省教育厅基本业务项目（项目编号：14 52 0 98 0 1、14 52 0 98 0 9）收稿日期：2 0 2 3-0 2-0 1菜籽粕等提供。提高我国现有蛋白饲料原料的生物利用率是解决饲料蛋白资源短缺的有效途径玉米蛋白粉是玉米湿法生产淀粉的主要副产物，其蛋白含量高达6 0%7 0%，可被用作蛋白饲料。但是，玉米蛋白粉醇溶蛋白含量高，且含有大量疏水性氨基酸，导致其水溶性差，作为饲料使用时生物利用率偏低。因此，如何提高玉米蛋白粉生物利用率是饲料行业呕待解决的关键问题微生物发酵过程中产生的蛋白酶类能够将蛋白粉中大分子蛋白质降解，从而提高蛋白利用率。魏炳栋等 2 采NO.212023饲料研究FEEDRESEARCH48试验研究用混菌发酵玉米蛋白粉，发酵液中粗蛋白含量提高了15.17%。本课题组前期研究发现，采用混菌固态发酵玉米蛋白粉时，发酵物可溶性蛋白含量由59.0 9mg/g提高至10 3.55mg/gl3)。日粮中添加10%玉米蛋白粉发酵饲料能够提高蛋鸡的生产性能，改善蛋品质(4 。与传统的微生物发酵相比，菌酶协同发酵可以更充分地降解饲料中难以消化吸收的物质，其产物具有抗营养因子含量低、目标产物得率高等特点。但是，酶制剂的加入导致发酵饲料成本提高。因此，本文以控制发酵饲料成本为前提，在低酶量条件下，采用枯草芽孢杆菌和酸性蛋白酶协同固态发酵玉米蛋白粉，提高其可溶性蛋白含量，进一步提高玉米蛋白粉的生物利用率，为制备高蛋白利用率的玉米蛋白粉发酵饲料提供参考。1材料与方法1.1原料与试剂酸菜，市售；玉米蛋白粉购自齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2 -联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；酸性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶购自沧州夏盛酶生物技术有限公司；碱性蛋白酶和复合蛋白酶购自Novozymes公司。1.2培养基脱脂乳粉筛选培养基：10%脱脂乳粉、2%琼脂，pH值自然，12 1灭菌2 0 min。玉米蛋白粉筛选培养基：3%玉米蛋白粉、2%琼脂，pH值自然，12 1灭菌2 0 min。1.3试验方法1.3.1菌株筛选及鉴定称取10.0 g酸菜，放入装有90 mL无菌生理盐水的三角瓶中，混合均匀后稀释，分别取10-3、10-4、10-5三个稀释梯度涂布于脱脂乳粉筛选培养基上，于37 恒温培养箱倒置培养4 8 h。通过计算菌体直径/透明圈直径比值进行蛋白酶高产菌株的初筛。随后，将筛选的蛋白酶高产菌株点种在玉米蛋白粉筛选培养基上，于37 下静置培养4 8 h。通过计算菌体直径/透明圈直径的比值进行复筛，最终筛选出可特异性降解玉米蛋白粉的菌株。以菌株基因组为模板进行PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳验证。随后将验证成功的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将获得的序列在NCBI上进行同源序列比对，对其进行分析鉴定1.3.2蛋白酶的筛选将膨化的玉米蛋白粉、小麦麸皮、豆粕和玉米胚芽粕以5：2：1：2 的比例混合作为制备发酵饲料的基质，将筛选到的菌种于LB培养基中过夜培养获取种子液。以发酵温度30、培养时间4 8 h，菌株接种量5%、物料含水量4 5%为发酵条件，将复合蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶分别以50 U/g加入基质中，在单向透气袋中进行生料固态发酵，以可溶性蛋白含量为指标筛选最适蛋白酶。1.3.3发酵条件的确定以发酵温度30、发酵时间4 8 h、物料含水量4 5%为初始发酵条件，研究加酶量、菌株接种量、含水量、发酵时间、发酵温度对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响。在单因素试验结果的基础上，确定影响可溶性蛋白含量显著的因素。以Box-Benhnken为设计原理设计响应面试验，以发酵饲料可溶性蛋白含量为指标，确定最佳发酵工艺条件。叫响应面试验因素及水平设计见表1。表1响应面试验因素及水平设计水平A加酶量/(U/g)B含水量/%C接种量/%-150402010045511505081.3.4饲料营养成分分析按照GB/T64321994、G B/T 6 4 332 0 0 6、G B/T64342006、G B/T 6 4 38 2 0 0 7、NY/T 14 592 0 0 7、GB/T 182462000、D B15/T 14 58 2 0 18、G B/T 6 4 36 2002、G B/T 6 4 37 2 0 0 2 方法分别测定发酵饲料中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、氨基酸、pH值、Ca和P含量；采用福林酚法和三氯乙酸法分别测定可溶性蛋白和多肽含量；采用SDS-PAGE分析饲料中蛋白质分子量分布。1.3.5发酵饲料抗氧化活性分析精确称取10.0 g玉米蛋白粉发酵饲料，溶解于装有80mL蒸馏水的三角瓶中，振荡2 h，蒸馏水定容至10 0 mL，12000r/min离心2 0 min，取上清液，过0.4 5m滤膜，冻干。参照文献 5 的方法检测发酵饲料对DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基的清除能力，以未发酵的饲料原料作为对照1.4数据统计与分析采用Excel2020软件对试验数据进行初步整理，利用GraphPadPrism8.0软件进行单因素方差分析，采用Tukeys法多重比较，结果以“平均值标准误”表示，P0.05）。这主要是由于初始发酵时，微生物利用底物中充足的营养物质进行大量繁殖，蛋白酶产量迅速提高，加速了底物中非水溶性蛋白质向水溶性蛋白质的转化；随着发酵时间的延长，基质中残余的可利用营养物质减少导致微生物生长受限，微生物蛋白酶产量降低使底物中可溶性蛋白含量增加缓慢。江成英等1研究结果与本研究结果一致。因此考虑到时间成本因素，确定最适发酵时间为7 2 h。140aaaa(3/)/日科影120b100d王8060402002550100150200300酶添加量/(U/g)(a）酶添加量140ab120100d806040200351015接种量1%(b)接种量180160a140b120100d80e60402002530405060含水量1%(c）含水量140aa1206b100d80604020202530354045发酵温度/(d)发酵温度1.50abababC125d10075e50250024487296120 144168发酵时间/h(e)发酵时间注：相同字母表示差异不显著(P0.05)，不同字母表示差异显著(P0.05)；下图同。图4单因素试验结果2.3.2响应面试验结果在单因素试验结果的基础上，固定发酵时间和发酵温度，选取加酶量（A）、物料含水量（B）和接种量（C）3个因素为响应变量，以饲料的可溶性蛋白含量为指标，以Box-Behnken为设计原理设计响应面试验，考察加酶量、物料含水量、接种量及其交互作用对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响。响应面试验结果见表3。对试验结果进行多元回归拟合，得到响应值为发酵饲料可溶性蛋白含量的二次回归模型：Y=137.34+0.27A+6.98B+8.07C-0.22AB+2.71AC-0.24BC-0.69A-0.63B2-12.23C对上述模型进行方差分析及回归模型系数显著性分析，结果见表4。结果显示，模型P0.05，说明模型拟合程度好，试验方法合理，可用来预测与分析加酶量、物料含水量和接种量3种因素对发酵饲料中可溶性蛋白含量影响的试验结果。回归模型R=0.9919，R a=0.98 14。通过F值可以判断影响发酵饲料中可溶性蛋白含量的3个因素的顺序为：CBA。通过P值检验回归系数的显著性，其中B、C、A C、C对响应值影响显著（P 0.0 5），其他因素组合对可溶性蛋白含量无显著影响7D005)NO.212023饲料研究FEEDRESEARCH51试验研究170.0010表3响应面试验结果A加酶量/B含水量/C接种量/可溶性蛋白含量/试验号(U/g)%(mg/g)1100455135.36 1.232100408126.27 0.663100508138.27 0.784150505144.23 0.72550405127.38 0.756100455137.83 0.447100502123.16 0.698150452113.21 0.539100455136.97 1.091050458130.21 1.1211150405129.21 0.9812150458135.32 0.771350455118.93 0.8114100455138.76 1.0115100455137.78 0.771650505143.26 1.2317100402110.21 0.94表4回归模型方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型1 586.489176.2894.900.000 1A0.6010.600.320.587 7B389.901389.90209.910.000 1C521.001521.00280.490.0001AB0.1810.180.100.761 6AC29.32129.3215.790.005 4BC0.2310.230.120.737 7A22.0012.001.080.333 4B21.6711.670.900.3745C630.041630.04339.190.000 1残差13.0071.86失拟6.4932.161.330.381 9纯误差6.5141.63总和1 599.4816注：P0.05表示影响显著；R=0.9919、R a=0.98 14。根据预测的模型得到二次回归方程的响应曲面图及等高线图，见图5。由图5可知，加酶量（A）和接种量（C）的交互作用对发酵饲料可溶性蛋白含量影响最显著，在3D曲面图表现为坡度较陡，等高线较密集，而加酶量（A）和含水量（B）的交互作用对发酵饲料可溶性蛋白含量影响不显著，3D曲线图较为平缓，等高线图较稀疏，这与方差的分析结果一致。响应面试验优化的玉米蛋白粉发酵饲料最优工艺条件为加酶量110.3U/g、含水量4 9.4%、接种量6.1%。在此优化条件下，发酵饲料可溶性蛋白含量为14 4.4 mg/g。考虑实际操作，调整工艺条件为加酶量10 0 U/g、含水量45%、接种量5%。根据上述条件，进行3次平行试验，发酵饲料的可溶性蛋白含量达到14 0.1mg/g。因此，该模型可用于对玉米蛋白粉发酵饲料可溶性蛋白含量随发酵条件变化情况进行预测可溶性蛋白含量/(mg/g)）(3/u)/号日科款50.015014047.51.4013012045.0511013542.550.015047.512540.045.042.5100507510012515075B：含水量4050A：加酶量A：加酶量(a)含水量和加酶量可溶性蛋白含量/（mg/g)(3/3）/日科然8.01501357.0140喜性1306.01205.01351104.01303.01258.01507.06.05.0A1251202.04.03.02100755075100125150C:接种量2.0.50A：加酶量A：加酶量(b）接种量和加酶量可溶性蛋白含量/(mg/g）8.011507.01401306.0141205.05-1104.01308.0503.0481207.06.05.0A464.03.0442.042404244464850C：接种量2.040B：含水量B：含水量(c）接种量和含水量图5各因素交互作用对可溶性蛋白含量的影响2.4发酵饲料成分分析2.4.1发酵饲料营养成分及pH值分析（见表5）由表5可知，与发酵前相比，发酵饲料中的可溶性蛋白含量提高了94.2%。主要是由于酸性蛋白酶与枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶协同发挥水解作用，使原有玉米大分子蛋白降解为具有一定空间结构的小分子蛋白，提高了玉米蛋白的溶解性。另一方面是由于枯草芽孢杆菌利用酸性蛋白酶的酶解产物和基质大分子物质合成新的蛋白类和酶类等营养物质，增加了基质可溶性蛋白含量。另外，研究表明，发酵饲料中可溶性蛋白含量的增加与枯草芽孢杆菌分泌的植酸酶、半纤维素酶等非淀粉多糖酶有关17。本研究发现，与发酵前相比，饲料中粗纤维和中性洗涤纤维含量分别降低了2 9.6%和11.0%，表明在发NO.212023饲料研究FEEDRESEARCH52试验研究酵过程中，枯草芽孢杆菌产生了如半纤维素酶、植酸酶和-葡聚糖酶等非淀粉多糖酶类，水解粗纤维和中性洗涤纤维，降低饲料中非淀粉多糖类物质的抗营养性。申春莉等18-9)采用纤维素、半纤维素酶活高的食用菌发酵豆渣，发现产生的纤维素酶和半纤维素酶能够分解纤维素和半纤维素，释放蛋白等营养成分，使发酵底物可溶性蛋白含量提高3.8 7 倍。饲料经发酵后，粗脂肪和淀粉含量分别降低了18.7%和2 4.5%，表明枯草芽孢杆菌能够分泌脂肪酶、淀粉酶水解脂肪、淀粉等大分子物质，生成利于动物吸收的脂肪酸和葡萄糖等小分子物质，提高饲料品质 10 1表5发酵饲料营养成分及pH值分析（干基）项目发酵前发酵后可溶性蛋白/(mg/g)72.13 1.43b140.10 1.78a粗蛋白/%41.32 0.1242.56 0.21粗脂肪/%3.95 0.07a3.12 0.09b粗纤维/%3.95 0.18a2.78 0.15b灰分/%3.28 0.153.24 0.11中性洗涤纤维/%22.23 0.22a19.79 0.18b酸性洗涤纤维/%7.78 0.177.76 0.13淀粉/%17.51 0.21a13.22 0.25bCa/%0.11 0.030.11 0.05P/%0.61 0.090.60 0.11pH值4.16 0.024.11 0.03注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05）。2.4.2发酵饲料蛋白分子量分布及多肽含量分析(见图6)M12100a250kDa72kDa8055kDa(3/)/喜号36kDa60b28kDa4017 kDa200发酵前发酵后(a)SDS-PAGE电泳(b)多肽含量注：M为标准分子蛋白；1为饲料发酵后；2 为饲料发酵前。图6发酵饲料蛋白质分子量分布图及多肽含量饲料中蛋白质分子量是反映其溶解性和生物活性的重要指标。饲料中小分子蛋白及多肽含量增加，有助于动物机体抗氧化能力和免疫力增强。由图6（a）可知，饲料发酵前，蛋白分子量主要分布在36 7 2 kDa之间，经过发酵后，发酵饲料主要蛋白分子量分布范围为小于2 8 kDa，且分子量小于17 kDa的蛋白含量显著增加。由图6（b）可知，饲料发酵后多肽含量为92.0 mg/g，与发酵前（52.8 mg/g)相比提高了7 4.3%。以上结果表明，菌酶协同发酵玉米蛋白粉可以将大分子玉米蛋白降解为小分子蛋白和多肽，提高玉米蛋白生物利用率。Jiang等 12 采用酸性蛋白酶和乳酸菌协同发酵玉米蛋白粉，其多肽含量和抗氧化能力显著提高，日粮中添加该发酵饲料能够提高断奶牛犊生长性能并缓解氧化应激反应2.4.3发酵饲料氨基酸组成(见表6)由表6 可知，饲料发酵后，各氨基酸含量均有不同程度的增加，总氨基酸和必需氨基酸含量分别增加97.9%和111.1%，说明饲料经发酵后，大分子蛋白被降解为氨基酸，饲料营养价值得到提升。Wang等13 研究发现，玉米蛋白粉经发酵后，总氨基酸含量显著提高。本研究中，饲料发酵后，呈味氨基酸谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸分别增加10 6.6%、97.6%、106.7%、116.5%、7 2.9%和54.3%。呈味氨基酸含量的增加能够赋予饲料特殊的鲜味儿，使饲料适口性增加，进而提升动物采食量。Wang等 14 研究表明，发酵饲料谷氨酸和赖氨酸含量增加，提高了饲料鲜味和动物采食量。此外，本研究中疏水氨基酸如甲硫氨酸、缬氨酸的大量增加，有助于发酵饲料抗氧化活性的增加。表6发酵饲料氨基酸组成(干基)单位：%项目发酵前发酵后项目发酵前发酵后丙氨酸.31.513.12赖氨酸2.40.510.66缬氨酸.40.491.09组氨酸?0.420.65亮氨酸.41.473.48精氨酸?0.400.82异亮氨酸I.40.380.69苏氨酸40.511.12脯氨酸!2.214.01丝氨酸0.861.69甲硫氨酸.40.110.31半胱氨酸0.060.12苯丙氨酸1.3.40.71.08总氨基酸13.8727.45谷氨酸32.124.38疏水氨基酸6.8713.78酪氨酸30.480.83碱性氨基酸1.332.13甘氨酸30.791.71呈味氨基酸6.4512.90天冬氨酸0.851.68必需氨基酸3.156.65注：1为疏水氨基酸；2 为碱性氨基酸；3为呈味氨基酸；4 为必需氨基酸。2.4.4发酵饲料抗氧化活性分析（见图7）菌酶协同发酵饲料中含有大量生物活性物质，可以提高动物抗氧化能力、抗病力和免疫防御机能 15-16 。DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力被广泛用于评价物质的抗氧化能力。发酵饲料抗氧化活性分析见图7。由图7 可知，饲料发酵后的DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力显著增强，最高可达7 6.7%和8 2.3%，与发酵前相比分别提高32.8%和58.1%，表明玉米蛋白粉饲料发酵后具有更高的抗氧化活性。研究表明，多肽含量的增加与基质的抗氧化活性的增加有关，多肽分子量越小，其抗氧化活性越强7 。赵丹等18 发现，豌豆蛋白水解物分子量小于3kDa组分的抗氧化活性高于分子量大于3kDa的组分。Liu等9研究发现，采用复合酶水解玉米蛋白粉制备的多NO.212023饲料研究FEEDRESEARCH53试验研究肽表现出很强的体外ABTS+自由基清除能力和活性氧清除能力。因此，推测发酵饲料多肽含量的显著增加是导致发酵饲料抗氧化活性增强的原因之一。此外，发酵饲料抗氧化活性与多肽中氨基酸组成有关，多肽序列C端相邻氨基酸残基为疏水氨基酸的多肽抗氧化活性高 2 0-2 1。王彬彬等 2 2 研究表明，酶解后玉米谷蛋白的抗氧化活性显著增强，是由于酶解导致的产物中疏水性氨基酸增加引起的，推测发酵饲料抗氧化活性的增加与亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸的增加有关。100发酵前80发酵后6040200.1 0.2 0.30.4 0.5 0.6 0.70.8 0.9 1.0样品浓度/g/L）(a)ABTS*自由基100发酵前%/率潮凰无甲月Hdd80发酵后6040200.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0样品浓度/g/L）(b)DPPH自由基图7发酵饲料抗氧化活性分析3结论枯草芽孢杆菌与酸性蛋白酶协同发酵玉米蛋白粉可以显著提高饲料中可溶性蛋白含量，提高玉米蛋白粉的生物利用率和饲料营养价值。但本文主要研究了单一菌株和单一酶制剂协同发酵对玉米蛋白粉生物利用率的影响，后续将采用复合菌株和复合酶制剂协同发酵制备玉米蛋白粉饲料，深入探索复合菌和复合酶协同发酵作用机制。参考文献1 Kopparapu N K,Duan Y,Huang L,et al.Review on utilisation of corngluten meal,a by-product from corn starch industry for production ofvalue-added productsl.International Journal of Food Science&Technology,2022,57(9):5592-5599.2魏炳栋,苗国伟,陈群,等.复合菌发酵玉米蛋白粉的条件优化.中国畜牧兽医,2 0 17,4 4(10):2 94 4-2 950.3韩国栋,刘晓兰,王燕,等.混菌固态发酵玉米黄粉饲料的研究.饲料工业,2 0 18,39(16):4 4-4 8.4易春霞,刘晓兰,王燕,等.发酵饲料对大午金凤蛋鸡生产性能,蛋品质和抗氧化能力的影响.饲料工业,2 0 2 0,4 1(11):4 6-51.5王婕嫂,刘睿,丁士勇,等，响应面优化混菌发酵蜂王幼虫制备抗氧化肽及其结构鉴定).食品与发酵工业,2 0 2 2,4 8(6):2 10-2 17.6江成英,刘晓兰,王松.固态发酵玉米黄粉饲料工艺的研究.中国饲料，2020,21(11):27-30.7 Wongputtisin P,Khanongnuch C,Khongbantad W,et al.Screening andselection of Bacillus spp.for fermented corticate soybean meal productionI.Journal of Applied Microbiology,2012,113(4):798-806.8申春莉.灵芝菌丝体固态发酵转化豆渣的研究 D.泰安：山东农业大学,2 0 19.9申春莉,李曼,沙见宇,等.灵芝菌丝体固态发酵豆渣的营养成分变化.食品与发酵工业,2 0 19,4 5(12):114-119.10 Karakurt Y,Guvercin D,Onder S,et al.Chemical,enzymatic,andantioxidant enrichments of full-fat soybean and sunflower meal byBacillus subtilis(ATCC 6633 TM)fermentation using a solid-statebioreactorJ.Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences,2019,43(1):82-93.11 Wang J H,Guo H,Zhang T R,et al.Growth performance anddigestion improvement of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicusfed by solid-state fermentation dietj.Aquaculture Nutrition,2017,23:1312-1318.12 Jiang X,Cui Z,Wang L,et 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