景宁木兰TCP家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析.pdf

热带亚热带植物学报 2023,31(5):623 633 Journal of Tropical and Subtropical Botany 收稿日期收稿日期:2022-04-28 接受日期接受日期:2022-06-15 基金项目基金项目:浙江省“十四五”育种专项(2021C02071-3)资助 This work was supported by the Special Project for the 14th Five Breeding of Zhejiang(Grant No.2021C02071-3).作者简介：任明杰(1997 年生)，男，硕士研究生，从事景宁木兰濒危机制研究。E-mail:*通讯作者 Corresponding author.E-mail: 景宁木兰景宁木兰 TCP 家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析 任明杰,陆丹迎,吴超,朱森宇,陈小珺,邬宇峰,申亚梅,马晶晶*(浙江农林大学风景园林与建筑学院，浙江省园林植物种质创新与利用重点实验室，南方园林植物种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，杭州 311300)摘要：摘要：为明确 TCP 转录因子家族在景宁木兰(Magnolia sinostellata)遮阴胁迫中的作用，通过模拟自然生境对景宁木兰 3 a 生嫁接苗进行遮阴处理，基于转录组分析 TCP 转录因子相关信息，利用转录组表达量和 qRT-PCR 分析遮阴胁迫下的表达模式。结果表明，从景宁木兰转录组中筛选出 12 个 TCPs 基因，编码蛋白长度为 228558 个氨基酸，分子量为 23.752.7 kDa，TCPs蛋白均为不稳定蛋白、亲水性蛋白；TCPs 均定位于细胞核，MsTCP20-a/b 蛋白还定位于叶绿体。TCPs 成员分为 2 大类，Class 包含 10 个 TCPs 成员，Class 包含 2 个 TCPs 成员。所有成员均含有 TCP 保守结构域，亲缘关系较近的成员具有相似的保守基序；克隆得到 TCPs 启动子序列，其序列含有大量光响应和激素响应元件。在遮阴处理后景宁木兰 TCPs 基因存在差异表达，其中 MsTCP9-a 与 MsTCP2 在遮阴后显著上升，MsTCP8、MsTCP9-b、MsTCP7-a、MsTCP15 在遮阴后显著下降。因此，景宁木兰 TCPs 可能在响应遮阴胁迫过程中发挥重要功能。关键词：关键词：TCP 转录因子家族;景宁木兰;遮阴;基因表达 doi:10.11926/jtsb.4663 Identification of TCP Family in Magnolia sinostellata and Expression Patterns of TCPs Under Shading Stress REN Mingjie,LU Danying,WU Chao,ZHU Senyu,CHEN Xiaojun,WU Yufeng,SHEN Yamei,MA Jingjing*(School of Landscape Architecture,Zhejiang Provincial Key Laboratory of Germplasm Innovation and Utilization for Garden Plants,Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Germplasm Innovation and Utilization for Southern Garden Plants,Zhejiang A&F University,Hangzhou 311300,China)Abstract:In order to investigate the role of TCP transcription factors family of 3-year-old Magnolia sinostellata grafted seedlings under simulated natural shading,the bioinformation of TCP transcription factors were analyzed based on transcriptome data,as well as their expression patterns under shading stress.The results showed that 12 TCPs were identified from the transcriptome data of M.sinostellata,encoding 228-558 amino acids with protein size of 23.7-52.7 kDa.All of 12 TCPs proteins were unstable and hydrophilic.The 12 TCPs located in cell nucleus,and MsTCP12-a/b also located in chloroplast.MsTCPs could be divided into two types,Class I contained 10 TCP members,and Class II with two TCP members.All members contained TCP conserved domains and the closely TCP members had similar conserved motifs.Meanwhile,the TCP promoter sequences of M.sinostellata were cloned and analyzed,which contained a large number of light response elements and hormone response elements.The MsTCPs were differentially expressed under shading treatment.MsTCP9-a,MsTCP2 were significantly up-regulated and MsTCP8,MsTCP9-b,MsTCP7-a,MsTCP15 were significantly down-regulated.624 热带亚热带植物学报 第 31 卷 Therefore,MsTCPs might play an important role in response to shade stress.Key words:TCP transcription factor family;Magnolia sinostellata;Shading;Gene expression 光照是植物生长发育所必须的外界环境因子,植物通过光合作用合成有机物满足自身营养需求,在森林群落中，上层常绿植物的冠层遮阴往往会减弱光强和改变光质进而影响下层植物的生长发育。遮阴会对不耐阴的植物造成一种重要的非生物胁迫，影响植物的营养生长1、花色2以及叶色34等性状。木兰科(Magnoliaceae)植物是一类古老的植物种群，由于全球气候变化、亚热带常绿阔叶林的演替，多数木兰科植物都面临灭绝的危险。木兰科濒危物种生境多呈破碎化，多分布于阳光充足的林缘与溪沟边，在林下生长势弱或幼苗较少58。景宁木兰(Magnolia sinostellata)是木兰科木兰属植物，其自然分布区狭窄，属于浙江省极小种群濒危物种。景宁木兰属偏阳性树种9，多生于针叶群落，在针阔叶群落中分布数量相对稀少，在常绿落叶群落中零星分布10，群落中上层乔木的遮阴环境可能是削弱景宁木兰生长势，从而造成其濒危的重要因素之一。TCP 是植物特有的一类转录因子家族，广泛参与植物生长发育、激素信号传递和逆境胁迫等多个生物学过程。根据 TCP 结构域的不同，TCP 家族可分为 Class I(PCF 或 TCP-P)和 Class II(TCP-C)两大类，Class II 类进一步分为 CIN 亚类和 CYC/TB1 亚类1112。在 Class I 类基因当中，水稻(Oryza sativa)PCF1 和 PCF2 参与 DNA 复制和控制细胞周期13。拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP8 在调控花期中发挥作用14，AtTCP14 和 AtTCP15 影响拟南芥的节间长度和叶片形状，同时介导赤霉素途径促进种子萌发15。菊花(Chrysanthemum morifolium)CmTCP20过表达能够增加菊花中侧根的数量和长度，并对侧根中生长素的积累产生积极作用16。Class II 类中，CIN 亚类基因参与调控叶形态，AtTCP2、AtTCP3、AtTCP4、AtTCP10 和 AtTCP24 受 miR319 的调控从而协调叶的发育17；CYC/TB1 亚类基因 AtTCP18/BRC1 在控制腋芽分枝发育中发挥作用18，AtTCP1能够结合油菜素内酯合成酶基因 DWARF4的启动子，进而调控其表达19。迄今为止，已对拟南芥20、茶(Camellia sinensis)21、棉花(Gossypium raimondii)22等多种植物的 TCP 转录因子开展研究，而在遮阴胁迫下的相关研究鲜有报道。本研究模拟景宁木兰野外林下光照强度对其进行遮阴处理并进行转录组测序，通过分析差异表达基因，发现景宁木兰 TCPs在遮阴胁迫下呈现差异表达，推测景宁木兰 TCPs可能响应遮阴胁迫从而调控景宁木兰的生长发育。因此本研究基于景宁木兰遮阴转录组数据，对景宁木兰 TCPs 转录因子家族开展鉴定分析，探究其生物信息学特性及遮阴环境下的表达模式，为深入了解景宁木兰 TCPs在遮阴下的调控网络奠定基础,最终为解释景宁木兰的濒危机制提供理论依据。1 材料和方法 1.1 材料材料 供试材料来自浙江省杭州市青山湖花园中心苗圃(3025 N，11981 E)培育的景宁木兰3 a 生嫁接苗。挑选长势、性状一致且无病害的嫁接苗作为材料，置于浙江省临安区浙江农林大学(3026 N,11973 E)人工气候室进行培养，设置温度为(252)、相对湿度为 40%60%、光照强度为 648 mol/(m2s)。为模拟景宁木兰野外遮阴环境，采用 3 层黑色遮阳网及竹竿搭建遮阴处理装置25%全光照，162 mol/(m2s),对照组幼苗不进行遮阴处理，其他条件保持不变。所有幼苗叶片间无重叠，每处理设置 3 个生物学重复。分别自处理的第 0、5、15 天采集景宁木兰中层叶片。所有样品取样后立即用锡箔袋包好，并迅速置于液氮中速冻，随后转入80 冰箱保存，用于后续 RNA 提取及荧光定量 qRT-PCR 反应，并委托深圳华大基因股份有限公司进行转录组测序，转录组测序中每个样本设置 3 个重复。1.2 TCPs 基因的筛选与理化性状分析基因的筛选与理化性状分析 景宁木兰 TCPs 基因的鉴定基于转录组测序数据。在转录组注释文件中的 NR、NT、Swiss-Prot等 3 个数据库中进行关键词筛选，初步筛选到 133个 TCPs 相关基因。用 TBtools 软件批量提取转录组氨基酸序列文件中对应基因的氨基酸序列，不存在氨基酸序列的基因不进行后续分析。通过 Pfam 和SMART 工具进一步分析结构域，剔除不含有 TCP 结构域的序列。通过 DNAman 进行对比，去除相同基因的冗余转录本，最终获得 12 个景宁木兰 TCPs 基因，并根据 TCP 拟南芥命名法及 NCBI blast 比对结第 5 期 任明杰等:景宁木兰 TCP 家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析 625 果进行命名。利用 ExPASy 中的 ProtParam 在线工具(https:/web.expasy.org/protparam/)预测景宁木兰 TCPs的氨基酸数量、等电点及分子量等理化性状；利用在线网站 Cell-PLoc 2.0(http:/ inf/Cell-PLoc-2/)预测亚细胞定位。1.3 TCPs 系统发育进化树构建系统发育进化树构建 利用 MEGA 6.0 将景宁木兰、拟南芥、望春玉兰(M.biondii)、水稻的 TCPs 氨基酸序列进行系统发育分析，采用邻接法(neighbor-joining)，1 000 次bootstrap检测，利用在线工具iTOL(https:/itol.embl.de/)对系统发育进化树进行优化。拟南芥、水稻的TCPs 氨基酸序列均下载自 PlantTFDB 网站(http:/planttfdb.gao-lab.org/index.php)，望春玉兰 TCPs 氨基酸序列筛选自望春玉兰基因组23。1.4 TCPs 氨基酸序列比对与保守结构域基序分析氨基酸序列比对与保守结构域基序分析 利用 Clustal Omega 在线工具(https:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对 12 个景宁木兰 TCPs 的氨基酸序列进行序列对比，利用 jalview 软件对多序列比对图谱进行优化；利用在线网站 MEME(https:/meme-suite.org/meme/tools/meme)对景宁木兰 TCPs蛋白进行保守基序预测分析，设置参数为：任意重复次数，最多基序数量为 10；利用 NCBI CDD 工具(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析景宁木兰 TCPs 蛋白保守结构域。1.5 TCPs 的启动子克隆及顺式作用元件预测的启动子克隆及顺式作用元件预测 利用DNA提取试剂盒提取景宁木兰基因组DNA;利用同属物种望春玉兰的基因组数据，从 pfam 数据库中下载 TCP 转录因子的 HMM(Hindden Markov Model,隐马尔科夫模型)文件，利用 hmmer 3.0 软件检索望春玉兰 TCPs 转录因子家族基因。调取望春玉兰基因组内景宁木兰同源 TCPs 基因上游 2 000 bp的启动子序列，根据望春玉兰 TCPs 启动子序列设计引物(表 1)，以景宁木兰 DNA 为模版，利用高保真酶扩增景宁木兰 TCPs 成员启动子片段，连接pCE2-TA 载体并转化大肠杆菌感受态，将阳性菌送往公司进行测序，获得景宁木兰 TCPs 启动子序列。通过 PlantCARE(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线网站对景宁木兰 TCPs启动子序列进行预测，利用 TBtools 进行可视化分析。表 1 景宁木兰 TCPs 启动子克隆引物 Table 1 Primers for TCPs promoter cloning of Magnolia sinostellata 基因 Gene 上游引物序列(53)Forward primer sequences 下游引物序列(53)Reverse primer sequence MsTCP8 CATTGGACCCACCCCTATTTGATTA CTACCCACATCCTGCTGGTCTGAAG MsTCP9-a ATTTAGGAGAGCCTGCATATCAACC TCTTCTTCCTTCTGCGGTTCCATTC MsTCP4 TGCACACTTCATGCCTGAGTTCCTA GTGGACTCATCTCTCGATTGACGGT MsTCP9-b CTGCTACGCTGATAGAAGTTGGAAG GACCTTCTTCATCTTCTTCCTCGCT MsTCP7-a CTGCTTGCGCCTACAACTACCCATA GGGCGTCAGAGGTAGACATAGAGCT MsTCP20-b AATAATAGCATGCAGGGGAGAGAAA GCTTGGGATCCATTGGAAAACAGAG MsTCP11 GTATTTAGGCATGTCCTGAAGTTTC GAGAGAGAGACTTCTAGGGTTTTAT MsTCP19 TTCAACGAGACGAACAAGAAATCCT CTCGGACATCTTGAAGAGAACCCTA MsTCP7-b AGTCGTGATTCTACTAGTGCGCAAG TTGTTTGGTGGAGAGTCTTGGGTAG MsTCP2 CGGGGCTTTGGATCAAGATTATATT CGCCATTAATAGCCGTTGATTTCGA MsTCP15 TCTCTCTGTAGTAAGCAAGTGGTGA ATGTGCGTATGTATATCTATCGTCG 1.6 TCPs 在遮阴胁迫下的表达分析在遮阴胁迫下的表达分析 在转录组中获得 12 个景宁木兰 TCPs 基因的FPKM 表达量数据，取平均值后利用 TBtools 软件进行归一化转换，利用 HeatMap 工具绘制热图。根据转录组数据结果，选取在遮阴处理第 5 和 15 天时表达量趋势一致的基因进行实时荧光定量实验。采用植物 RNA 提取试剂盒提取样品总 RNA，利用反转录试剂盒进行第 1 链 cDNA 的合成。根据景宁木兰转录组数据，利用 Premier 5.0 软件设计特异性引物(表 2)，景宁木兰 EF1-基因作为内参基因2425，引物均交由生物公司进行合成。利用Light Cycler 480II(Roche)仪器进行目的基因荧光定量 qRT-PCR 表达分析。实时定量反应体系为10 L，包括 2 L cDNA、5 L BCG qPCR Master Mix、上、下游引物(10 mol/L)各 0.4 L、ddH2O补足至 10 L,设置 3 个重复。反应程序为：95 预变性 30 s，然后 95 变性 5 s，58 30 s，共40 个循环。反应程序结束后，65 95 每隔 0.2 s 626 热带亚热带植物学报 第 31 卷 表 2 荧光定量引物 Table 2 Primers for qRT-PCR 基因 Gene 上游引物序列(53)Forward primer sequences 下游引物序列(53)Reverse primer sequence MsTCP8 CCGCCCTCAATGCTTACAACA CTCCACTATCTGCTCCTCCTT MsTCP9-a AACCGCAGAAGGAAGAAGAAG GTGGATGGAGGAGGAGAAAGG MsTCP9-b AACGGCTGCGATGGGTGCTT GGTTGCGGGAGGGTTGTGGT MsTCP7-a GGCAGCTCCAGTTACAACCC ACGTGCGGCACAGATGATAG MsTCP19 GATGTGGTGAAAGTGGAGGTG TGCTGAGCTGCATTATGGGTC MsTCP2 GCTGCCGATGCTATTGCTGAG CTGCTGCTGCTGTTGTTGCTG MsTCP15 CTGAGGATGAGGAGCGAGTG CAGCGTTTGGTTGAGGGAGT EF1-GATGATTCCAACCAAGCCCA CACCCACTGCAACAGTCTGG 作溶解曲线，采用 2CT法计算目的基因的相对表达量。利用 SigmaPlot 14 进行绘图，SPSS 24.0 进行显著性分析，采用独立样本 t 检验进行比较，显著性水平为 0.05。2 结果和分析 2.1 TCPs 的鉴定及理化性状分析的鉴定及理化性状分析 基于景宁木兰转录组数据库，最终鉴定出 12个 TCPs 基因。利用 ExPASy 对 12 个景宁木兰 TCPs蛋白进行氨基酸数量、等电点和分子量等理化性状分析，结果表明 TCPs 成员物理性质存在较大差异。氨基酸数量最多是 MsTCP19，包含 558 个氨基酸,氨基酸数量最少是 MsTCP11，包含 228 个氨基酸;等电点为 6.24(MsTCP11)9.98(MsTCP7-b);分子量为 23.7(MsTCP11)52.7 kDa(MsTCP8)；12 个TCPs 蛋白均为不稳定蛋白、亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果表明，12个TCPs均定位于细胞核,其中 MsTCP20-a、MsTCP20-b 还定位于叶绿体(表 3)。2.2 TCPs 系统进化分析系统进化分析 利用 MEGA6.0 软件将景宁木兰、拟南芥、水稻和望春玉兰的 TCPs 氨基酸序列进行对比，采用邻接法构建系统发育进化树(图 1)。结果表明，景宁木兰TCPs 成员可被分为 Class I 和 Class II 两大类，其中Class I 类包含 10 个 TCPs 成员，Class II 类包含两个TCPs 成员，且 Class II 中的 CYC/TB1 亚家族无景宁木兰TCP 成员。此外，景宁木兰 TCP9 含有两个同源基因 MsTCP9-a/MsTCP9-b；TCP20 含有两个同源基因 MsTCP20-a/MsTCP20-b；TCP7 含有两个同源基因MsTCP7-a/MsTCP7-b。2.3 TCPs 氨基酸序列对比氨基酸序列对比 利用Clustal Omega工具将12个景宁木兰TCPs氨基酸序列进行对比分析(图 2)，结果表明 12 个TCPs 均包含 1 个完整的 TCP 结构域，即高度保守且非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域。在 TCP 结构域中共有 13 个高度保守的氨基酸，其中 Basic 区域含有 8 个，保守程度较高。Basic 区域中，10 个TCPs氨基酸序列出现4个氨基酸的缺失，属于Class 表 3 景宁木兰 TCPs 成员基本信息 Table 3 Basic information of TCPs in Magnolia sinostellata 基因 Gene 氨基酸 Amino acid 等电点 PI 分子量(Da)Molecular weight 不稳定系数 Instability index 脂肪系数Aliphatic index 平均亲水性 GRAVY 亚细胞定位 Subcellular localization MsTCP8 504 7.38 52 689.45 55.94 65.44 0.508 Nucleus MsTCP9-a 358 6.62 38 340.07 65.33 65.47 0.589 Nucleus MsTCP4 401 6.46 43 701.05 62.62 59.03 0.754 Nucleus MsTCP9-b 343 9.26 36 497.17 68.10 68.60 0.537 Nucleus MsTCP7-a 283 9.55 29 827.80 56.59 83.14 0.195 Nucleus MsTCP20-a 333 9.51 35 457.12 52.71 76.55 0.476 Chloroplast/Nucleus MsTCP20-b 311 9.36 32 763.84 50.39 70.26 0.463 Chloroplast/Nucleus MsTCP11 228 6.24 23 703.30 68.91 65.09 0.512 Nucleus MsTCP19 558 6.35 61 001.02 56.22 71.31 0.595 Nucleus MsTCP7-b 292 9.98 31 058.02 65.78 73.25 0.469 Nucleus MsTCP2 458 6.74 49 716.56 60.46 58.49 0.805 Nucleus MsTCP15 359 7.97 38 712.89 56.55 55.26 0.682 Nucleus 第 5 期 任明杰等:景宁木兰 TCP 家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析 627 图 1 景宁木兰(Ms)与拟南芥(At)、水稻(Os)和望春玉兰(Mb)TCPs 的系统进化分析 Fig.1 Phylogenetic tree of TCPs in Magnolia sinostellata(Ms),Arabidopsis thaliana(At),Oryza sativa(Os)and M.biondii(Mb)图 2 景宁木兰 TCPs 的氨基酸序列对比 Fig.2 Alignment of TCPs amino acid sequence in Magnolia sinostellata I 类，MsTCP4 与 MsTCP2 属于 Class II 类。Class I类氨基酸序列与 Class II 类氨基酸序列在 Helix I、Loop 及 Helix II 区域差异较大，且 Class I 类氨基酸序列之间保守性较高。2.4 TCPs 的基序及保守结构域分析的基序及保守结构域分析 利用MEME在线工具对景宁木兰TCPs蛋白进628 热带亚热带植物学报 第 31 卷 行保守基序分析，其中 motif1 为 TCP 结构域，存在于 12 个 TCPs 成员当中。景宁木兰 TCPs 蛋白保守基序的组成具有一定差异性，不同 TCP 成员含有不同保守基序，但亲缘关系较近的成员具有相似的保守基序，如 MsTCP9-a 与 MsTCP9-b、MsTCP7-a与 MsTCP7-b、MsTCP20-a 与 MsTCP20-b。利用 NCBI CDD工具对景宁木兰TCPs 蛋白进行保守结构域分析，结果表明均含有 TCP 结构域，属于 TCP 转录因子家族(图 3)。2.5 TCPs 启动子克隆及顺式作用元件预测启动子克隆及顺式作用元件预测 根据系统发育进化树分析结果，以同属植物望春玉兰 TCPs 同源基因启动子序列设计引物，利用景宁木兰 DNA 作为模版，除 MsTCP20-a 未能在望春玉兰中匹配到 TCP 同源基因外，其余景宁木兰TCPs 基因均采用同源克隆的方法扩增到启动子片段，对目的条带进行回收(图 4)，连接 pCE2-TA 载体，挑选阳性菌送往公司进行测序，测序结果与望春玉兰 TCPs 启动子序列匹配度均达到 95%以上。利用 PlantCARE 对景宁木兰 TCPs 启动子进行顺式作用元件预测，发现光响应元件数量最多，且存在于所有 TCPs 家族成员中，表明 TCPs 家族成员均可能受到外界光照的调控，弱光环境下将影响景宁木兰 TCPs 家族的基因表达。生长素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸、赤霉素 5 大类激素顺式作用元件 图 3 景宁木兰 TCPs 保守结构域和基序 Fig.3 TCPs conserved domains and motifs in Magnolia sinostellata 图 4 景宁木兰 TCPs 启动子的 PCR 扩增 Fig.4 PCR amplification of TCPs promoters in Magnolia sinostellata 第 5 期 任明杰等:景宁木兰 TCP 家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析 629 存在于 TCPs 基因启动子中，说明激素对 TCPs 基因可能存在潜在的调控作用。此外，低温响应元件(CCGAAA)、细胞周期调控元件(TCCAACGGT)、分生组织表达元件(GCCACT)、玉米蛋白代谢调节元件(GATGACATGG)、防御和胁迫响应元件(ATT-CTCTAAC)等存在于 TCPs 基因启动子中，表明景宁木兰 TCPs 基因可能在参与植物生长发育、响应生物及非生物胁迫中发挥重要作用(图 5)。图 5 景宁木兰 TCPs 启动子顺式作用元件预测 Fig.5 Cis-acting element prediction of TCPs promoters in Magnolia sinostellata 2.6 遮阴条件下遮阴条件下 TCPs 表达分析表达分析 通过转录组测序技术获得了在对照的第 0(CK D0)、5(CK D5)、15 天(CK D15)及遮阴第 5(ST D5)、15天(ST D15)的FPKM值，取平均值后运用TBtools工具绘制热图(图 6)。结果表明，在遮阴胁迫下 12个 TCPs 成员均发生差异性变化，其中 MsTCP9-a、MsTCP2 的表达量在遮阴后第 5、15 天后均呈上升趋势；MsTCP8、MsTCP9-b、MsTCP7-a、MsTCP19、MsTCP15 的表达量在遮阴后第 5、15 天后均呈下降趋势，其余 TCPs 成员的表达量变化不呈现规律性。根据景宁木兰 TCPs 转录组数据分析结果，对MsTCP8、MsTCP9-a、MsTCP9-b、MsTCP7-a、MsTCP19、MsTCP2、MsTCP15 等 7 个基因进行实时荧光定量 qRT-PCR 检测，结果表明，MsTCP9-a和 MsTCP2 的表达在遮阴后第 5、15 天均呈上升趋势，而 MsTCP8、MsTCP9-b、MsTCP7-a、MsTCP15则呈下降趋势(图 7)。虽然景宁木兰TCPs荧光定量结果在遮阴后的变化与转录组不同，但遮阴后的变化趋势与转录组总体一致，说明 MsTCP8、MsTCP9-a、MsTCP9-b、MsTCP7-a、MsTCP2、MsTCP15 能够响应遮阴胁迫。3 结论和讨论 上层树冠遮阴是影响下层植株生长发育的重要非生物胁迫，TCP 是高等植物特有的一类转录因子家族，在植物生长发育及响应外界胁迫中发挥重要作用。景宁木兰是浙江省极小濒危物种，上层乔 图6 遮阴下景宁木兰TCPs 表达量热图。CK:对照;ST:遮阴;D0:第0 天;D5:第 5 天;D15:第 15 天。下同 Fig.6 Heatmap of expression of MsTCPs under shading.CK:Control;ST:Shading;D0:The 0 day;D5:The 5th day;D15:The 15th day.The same below 630 热带亚热带植物学报 第 31 卷 图 7 遮阴下景宁木兰 TCPs 的 qRT-PCR 分析。*:P0.05 Fig.7 qRT-PCR of MsTCPs under shading.*:P0.05 木的遮阴可能是导致其濒危的重要因素之一。本研 究通过分析景宁木兰遮阴转录组数据，发现 TCP 呈差异表达。为了探讨景宁木兰 TCPs 在遮阴胁迫下的功能，本研究首先基于转录组数据筛选得到 12个景宁木兰 TCPs 成员，这与拟南芥20、水稻26及望春玉兰的 TCPs 成员数量存在差距，一方面可能由于景宁木兰存在物种特异性，另一方面可能由于基因表达存在时空特异性，未能在叶片转录组数据库中鉴定出。亚细胞定位预测表明，12 个 TCPs 均符合其转录因子特性，定位于细胞核中，其中MsTCP20-a、MsTCP20-a 定位于叶绿体中，这与茶树 CsTCP2127、油菜(Brassica napus)的 BnTCP3628等定位在叶绿体的结果相一致，暗示其可能在叶绿体中发挥功能。在系统发育进化树中，拟南芥 TCPs 成员被分为 Class I 和 Class II 两大类，Class II 进一步被分为CYC/TB1 和 CIN 亚类，这与前人20研究结果一致。景宁木兰 TCPs 成员在 Class I 类和 CIN 亚类中均有分布，但不存在 CYC/TB1 亚类，可能由于此类基因在叶中不发挥功能，CYC/TB1 亚类基因主要控制植物花型的对称性29。氨基酸序列分析表明所有景宁木兰 TCPs 成员均含有 TCP 结构域，但不同类的TCPs 成员其氨基酸序列和保守基序存在差异，说明其功能存在多样性。基因启动子是调控基因转录的重要元件30。本研究基于望春玉兰基因组，通过同源克隆的方法获得11个景宁木兰TCPs启动子序列，MsTCP20-a 未能在望春玉兰基因组匹配到同源基因，可能是物种间基因数量存在一定的差异性。通过分析景宁木兰 TCPs 启动子序列，发现 TCPs启动子含有大量光响应元件及脱落酸、茉莉酸等激素响应元件，这与桃(Prunus persica)的 TCPs 启动子作用元件分布类型相似31，表明景宁木兰 TCPs 可能响应遮阴环境所导致的光信号与激素信号变化。基因的表达模式变化通常能够反映其对非生物胁迫的应答能力。本研究结合转录组数据和qRT-PCR 技术对景宁木兰 TCPs 在遮阴胁迫后的表达量进行了分析，结果表明 MsTCP9-a 和 MsTCP2表达显著上升，MsTCP8、MsTCP9-b、MsTCP7-a、MsTCP15 表达显著下降。气孔在响应胁迫中发挥重要作用，遮阴胁迫会加速植物气孔的闭合3233。TCP9 基因在豇豆(Vigna sinensis)调控气孔大小中发挥作用34，景宁木兰 MsTCP9-a 与 MsTCP9-b 在遮阴胁迫下表达量呈差异性变化，推测 MsTCP9-a 与MsTCP9-b可能介导遮阴胁迫下景宁木兰的气孔开度。遮阴胁迫会促进植物茎的伸长生长，在矮牵牛(Petunia hybrida)中，TCP2 能够介导矮牵牛茎的伸长生长35，景宁木兰MsTCP2表达量呈显著性变化，推测其可能调控遮阴胁迫下景宁木兰茎的伸长生长。遮阴胁迫会诱导植物体生长素含量上升从而产生庇荫反应，然而过度遮阴会抑制植物体内生长素 水平36。拟南芥 AtTCP15 在生长素信号传导中起到重要作用37，景宁木兰 MsTCP15 基因在遮阴胁迫下显著下调，推测其可能介导遮阴胁迫下景宁木兰的生长素信号传导过程。水杨酸在植物免疫和抗病反应中发挥重要作用，遮阴胁迫下植物水杨酸含量呈下降趋势38，拟南芥 AtTCP8 能够调控水杨酸合成第 5 期 任明杰等:景宁木兰 TCP 家族鉴定及遮阴胁迫表达模式分析 631 酶基因 ICS1 的表达39。遮阴胁迫下景宁木兰 AtTCP8下调，可能导致水杨酸合成受阻从而降低植物的抗性。景宁木兰 MsTCP7-a 表达量呈下调趋势，这与甘蓝型油菜 BnTCP7 在温度胁迫、损伤胁迫等非生物胁迫下的表达趋势相一致40。本研究基于景宁木兰遮阴处理转录组数据，共鉴定得到 12 个景宁木兰 TCPs 成员；其蛋白均为不稳定蛋白、亲水性蛋白；12 个 TCPs 均定位于细胞核，符合其转录因子特性，此外 MsTCP20-a/b 还定位于叶绿体；景宁木兰 TCPs 成员可分为 Class 和Class 两大类，Class 包含 10 个 TCPs 成员，Class 包含两个 TCPs 成员，亲缘关系较近的成员具有相似的保守基序；对景宁木兰 TCPs 启动子进行同源克隆后发现含有大量光响应和激素响应元件；景宁木兰 TCPs 成员能够响应遮阴胁迫，其中 MsTCP9-a与 MsTCP2 表达量显著上升，MsTCP8、MsTCP9-b、MsTCP7-a、MsTCP15 表达量显著下降。参考文献参考文献 1 CHEN T T,ZHANG H J,ZENG R E,et al.Shade effects on peanut yield associate with physiological and expressional regulation on photosynthesis and sucrose metabolism J.Int J Mol Sci,2020,21(15):5284.doi:10.3390/ijms21155284.2 ZHAO D Q,HAO Z J,TAO J.Effects of shade on plant growth and flower quality in the herbaceous peony(Paeonia lactiflora Pall.)J.Plant Physiol Biochem,2012,61:187196.doi:10.1016/j.plaphy.2012.10.005.3 QIAN P X,LI X F,WU Y Y,et al.Influen