咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立与应用.pdf

特产研究Special Wild Economic Animal and Plant Research1DOl:10.16720/ki.tcyj.2022.164咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立与应用吴伟怀1#，刘宝慧2#，汪全伟3，鹿鹏鹏1，贺春萍1,梁艳琼1,黄兴1，易克贤1,4（1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南海口57 110 12.南京农业大学植物保护学院，江苏南京2 10 0 95;3.中国热带农业科学院科技信息研究所，海南海口57 110 1；4.中国热带农业科学院三亚研究院，海南三亚57 2 0 0 0)摘要：由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌（Hemileiavastatrix)引起的咖啡叶锈病是小粒种咖啡生产中的一种毁灭性病害，建立高效、准确的分子检测技术对于该病害的快速鉴定与监测具有重要意义。本研究基于咖啡叶锈病菌ITS序列保守区域设计该病原菌的单管巢式引物对，通过单因素试验筛选外引物与内引物退火温度后，进一步对单管巢式PCR检测反应体系的内、外引物浓度、dNTPs浓度、以及rTaq酶用量等4个关键因素进行正交优化试验，从而建立高效的单管巢式PCR检测反应体系。结果表明，咖啡叶锈病菌单管巢式PCR外引物HvF1/HvR1、内引物HvF2/HvR2的最佳退火温度分别为6 3与52。正交试验显示，在2 0 L的反应体系中各组分的最佳含量分别为:10 rTaq Buffer 2.5L,2.5 mmol/LdNTPs 3.2 L,rTaq DNA Polymerase(5 U/L)1.8L,7mol/L的 HvF2/HvR2各1L，1n mo l/L的HvF1/HvR1各1L，模板DNA1L,ddH27.5L。所建立的单管巢式PCR检测体系具有高度特异性，能从含有咖啡叶锈病菌DNA模板中检测出特异性条带，而其他供试的非咖啡叶锈病菌DNA模板中扩增不出任何条带。该检测技术体系的最低检测限为5fg/L，是普通PCR灵敏度的10 0 倍。采集的2 2 份早期疑似病样经检测鉴定均含有咖啡驼孢锈菌。本试验建立的单管巢式检测技术可用于咖啡叶锈病菌的快速鉴定，可用于病害监测预警。关键词：咖啡叶锈病；驼孢锈菌；单管巢式PCR中图分类号：S435.712Establishment and Application of Single Tube Nested PCR DetectionSystem for Hemileia vastatrix Causing Coffee Leaf Rust文献标识码：A文章编号：10 0 1-47 2 1(2 0 2 3)0 5-0 0 0 1-0 8WU Weihuail#,LIU Baohui2#,WANG Quanwei3,LU Pengpengl,HE Chunpingl,LIANG Yanqiongl,HUANG Xingl,YI Kexianl.4*(1.Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Key Labora-tory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests,Environment and Plant Protection Institute,Chinese Academyof Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,China;2.College of Plant Protection,Nanjing Agricultural University,Nan-jing 210095,China;3.Institute of Information and Technology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou571101,China;4.Sanya Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Sanya 572000,China)Abstract:Coffee leaf rust,caused by the obligate parasite Hemileria vastatix,is a devastating disease in the production of Coffea Arabica.It is of great practical significance to establish an efficient and accurate molecular detection technique for rapid identification and monitoringof this disease.In the present study,a single-tube nested primer for H.vastatrix was designed based on ITS sequences that have conservativeregion,after screening the annealing temperature of the outer and inner primers by single factor test,four key factors,such as the concentra-收稿日期：2 0 2 2-0 5-19基金项目：中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金（16 30 0 42 0 17 0 2 1)；FA0/IAEA合作研究项目（2 0 38 0)；中葡咖啡锈病联合研究和技术交流项目（12 2 0 0 0 31）作者简介：#为共同第一作者。吴伟怀（197 7-），男，湖南汨罗人，博士，副研究员，从事特色热作病害研究；刘宝慧（1993-），女，河北衡水人，在读硕士研究生，从事特色热作病害研究。通讯作者：易克贤（196 4-)，男，广西阳朔人，博士，研究员，博士生导师，从事特色热作病害研究。2tion of inner and outer primers,the concentration of dNTPs and the dosage of rTaq enzyme,were optimized by the orthogonal design,thus,an efficient single-tube nested PCR system was established.Then the specificity and sensitivity of the single-tube nested PCR detection sys-tem were analyzed.The results showed that when the optimal annealing temperature of the single-tube nested PCR primer HvF1/R1 and theinner Primer HvF2/HvR2 were 63 C and 52 C respectively,and the optimum contents of each component in the 20 L reaction system wereselected as follows:10 xrTaq Buffer 2.5 L,2.5 m mol/L dNTPs 3.2 L,rTaq DNA polymerase(5 U/L)1.8 L,7 mol/L HvF2/HvR2 prim-ers each 1 L,1 nmol/L HvF1/HvR1 primers each 1 L,template DNA 1 L,dd H2O 7.5 L.The single-tube nested PCR detection systemcan only detect the specific bands from the DNA template containing the H.vastatrix,while the other non-H.vastatrix DNA template cannotdetect any bands,show a high degree of specificity.Based on this,the minimum detection limit of the single-tube nested PCR detection sys-tem is 5 fg/L,which is 100 times higher than that of the conventional PCR system with sensitivity of 0.5 pg/L.Twenty-two early suspectedsamples were tested and identified to all contain H.vastatix by single-tube nest PCR,The method established in this study can be used forrapid identification of H.vastatix,disease monitoring and early warning.Key words:coffee leaf rust;Hemileia vastatrix;single-tube nested PCR由咖啡驼孢锈菌（Hemileiavastatrix）引起的咖啡叶锈病是小粒种咖啡生产中一种毁灭性病害1-3。该病害病原的鉴定主要依赖常规的形态学并结合传统的鉴别寄主法。该方法需经过病原菌的分离或者直接获得病原菌的孢子，经过形态鉴定，再由科赫氏法则验证，此流程大约需要1个月时间，同时还要求具备专业的分类学知识以及丰富的经验。除此之外,还需要有一个比较干净的接种环境，否则咖啡叶锈病菌夏孢子很容易被重寄生菌侵染，干扰试验结果4-6 ,准确性和可信度易受外界因素的影响，难以满足快速、高通量鉴定与检测的实际需求。由此可见，建立一种高效、准确的分子检测技术对于该病害的快速鉴定与监测具有重要意义。白学慧等7 采用国际通用的19 个咖啡锈菌小种鉴别寄主，利用人工接种鉴定的方法，对2 0 11 2 0 15年采自云南咖啡主产区的51份咖啡锈菌进行了致病性测定，基于其致病表型从而鉴定出9 个生理小种。汪涵等8 利用咖啡驼孢锈菌DNA核糖体转录间隔区ITS1ITS4 特异性区域设计的 1 对特异性引物 Hv-ITS-F/R，仅能从咖啡驼孢锈菌基因组DNA中扩增出396 bp的特异条带,而其他相似或相近的病原真菌则无扩增条带。该检测技术检测浓度可达10 pg/uL,但是普通PCR检测仍不够灵敏。随着分子生物技术的快速发展，许多分子检测技术由于具有快速、高灵敏度而被广泛应用于植物病原菌的诊断与鉴定中，比较常见的是巢式PCR检测技术9,10 。但是，由于巢式PCR需要进行2 轮独立的PCR扩增反应,第二轮PCR扩增反应是以第1轮PCR扩增产物为模板，在这过程中需要开管进行模板转移，从而增加了污染的概率11,而单管巢式PCR是在巢式 PCR 技术发展而来,这就使得单管巢式PCR检测技术不仅具有巢式PCR检测技术的特异性和灵敏性，还能节省时间、节约成本，同特产研究时又具有可降低潜在污染风险等优点，具有较好的发展前景12-14。目前关于咖啡叶锈病菌单管巢式PCR的检测体系尚未建立。针对传统咖啡锈菌鉴定与监测方法费时费力，以及检测技术灵敏度不够高等问题，本研究拟建立咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系，为咖啡叶锈病的早期诊断与病害监测提供快速、可靠的技术支撑。1材料与方法1.1供试材料本试验所用的供试样品DNA包括咖啡驼孢锈菌(H.vastatix）、甘蔗黄锈病菌（Puccinia kuehni）、甘蔗褐锈病菌（P.melanocephala)、鸡蛋花鞘锈菌（Coleos-porium plumierae)、葡萄层锈菌(Phakopsora ampelop-sidis）、咖啡炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）、咖啡褐斑病菌（Cerosporacoffeicola)、咖啡腐皮镰孢黑果病菌（Fusariumsolani）、咖啡露湿拟漆斑菌（Para-myrotheciumbreviseta)以及咖啡拟多盘毛孢叶斑病菌(Pestalotiopsis trachicarpicola)，表1。其中2 份咖啡驼孢锈菌经提取核酸后检测与克隆测序确认为咖啡驼孢锈菌后，作为本研究的阳性样品，其余甘蔗黄锈病菌、咖啡炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、鸡蛋花鞘锈菌、葡萄层锈菌、咖啡腐皮镰孢黑果病菌、咖啡露湿拟漆斑菌和咖啡拟多盘毛孢叶斑病菌样品均经提取核酸与克隆测序确定含有相应病菌后，作为特异性分析模板。所有菌株DNA样品均保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。1.2咖啡叶锈病菌病叶DNA提取采用CTAB法(Hexadecyl trimethyl Ammonium Bro-mide，十六烷基三甲基溴化铵法)15,对咖啡叶锈病叶进行DNA提取,DNA样品置于-2 0 冰箱保存备用。2023年第45卷第5期第5期序号菌株No.Strain1Hv532Hv643Pk214Pk245JML6PAL7Pml8Pm21.3引物设计与合成将咖啡叶锈病菌ITS序列与NCBI公共数据库中同源性较高的序列进行多重比较，获取咖啡叶锈病菌ITS序列的特异性区段。通过primerexplorer5.0在线软件对多态性丰富区域设计引物，参考引物设计原理，并结合单管巢式PCR引物设计原理：一般外引物退火温度高于内引物10 左右，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司广州合成部合成。1.4外引物与内引物最佳退火温度为了进一步确认咖啡叶锈病菌的单管巢式PCR最佳的退火温度，对所设内引物进行52 6 3梯度退火温度扩增，筛选出最佳退火温度；在内引物最佳退火温度的基础上，对外引物设置梯度退火温度6 0 7 2，从中筛选出高于内引物最佳退火温度大约10 的外引物最佳退火温度。扩增均采用2 0 L反应体系：ddH2014.3L，10 xrTaq Buffer 2 L,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 L,rTaq DNATable 2 Factors and levels of single-tube nested-PCR reaction system for H.vastatrix causing coffee leaf rust因素 Factor外引物浓度/(pmol/L)内引物浓度/(mol/L)dNTPs/(mmol/L)rTaq 酶/(5 U/L)(U)吴伟怀，等：咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立与应用Table 1Strains used in this study采集地病原菌Sampling sitePathogen咖啡叶锈病菌云南瑞丽Hemileriavastatix咖啡叶锈病菌云南瑞丽Hemileriavastatix甘蔗黄锈病菌广东雷州Pucciniakuehnii甘蔗黄锈病菌广东雷州Pucciniakuehnii鸡蛋花鞘锈病菌海南海口Coleosporium plumierae葡萄层锈病菌海南文昌Phakopsoraampelopsidis甘蔗褐锈病菌广东雷州Puccinia melanocephala甘蔗褐锈病菌广东雷州Puccinia melanocephala表2 咖啡叶锈病菌单管巢式PCR反应体系正交试验的各因素及水平I500.050.133表1供试菌株序号菌株No.Strain9CCG210CCG311CfL912CfL1413CPE514CPE1215DRL216HPE1Polymerase（5U/L)0.1 L,10 mol/L的上下引物各0.5 L,30 ng/L 模板 DNA 1 L。内引物的反应程序为:94预变性 3min,94变性30 s，梯度退火温度（52 6 3)退火10 s，7 2 延伸2 5s,35个循环，7 2 延伸4min，12 保存。外引物的反应程序为：94预变性3min，94变性30 s，梯度退火温度（6 0 7 2)退火10 s，7 2 延伸2 5s,35个循环,7 2 延伸4min,12保存。1.5单管巢式PCR反应体系优化为了获得较为理想的单管巢式PCR反应体系，在确定外内引物退火温度的基础上，利用SPSS26.0对外、内引物浓度,dNTPs浓度，rTaq酶量等体系关键因素进行正交实验设计，各设定4个水平，见表2。选用正交表L16(44)设计试验，见表3。单管巢式PCR反应体系的各试验总体积为2 0 L,每个试验均加入2.5L10 xrTaqBuffer和咖啡叶锈病菌DNA1L,其他成分按照正交设计的浓度用量加入，ddH20补足至2 0 L。水平LevelI5x10-10.20.25采集地Sampling site海南詹州海南詹州云南瑞丽云南瑞丽云南普洱云南普洱云南瑞丽云南普洱II5x10-30.350.47病原菌Pathogen咖啡炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides咖啡炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides咖啡褐斑病菌Cerospora coffeicola咖啡褐斑病菌Cerospora coffeicola咖啡腐皮镰孢菌Fusariumsolani咖啡腐皮镰孢菌Fusarium solani咖啡露湿拟漆斑菌Paramyrothecium breviseta咖啡拟多盘毛孢菌PestalotiopsistrachicarpicolaIV5x10-40.50.594Table 3 L16(44)orthogonal test design on different factors and levels of single tube nested PCR for H.vastatrix causing coffee leaf rust组合Combination123456789101112131415161.6单单管巢式PCR检测体系特异性分析与酶切验证以咖啡驼孢锈菌、甘蔗黄锈病菌、甘蔗褐锈病菌、鸡蛋花鞘锈菌、葡萄层锈菌、咖啡炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、咖啡腐皮镰孢菌、咖啡露湿拟漆斑菌和咖啡拟多盘毛孢菌等共计16 份菌株DNA为模板（表1)，并以ddH2O为阴性对照。利用1.5筛选出的咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系进行特异性分析。采用 Apol I 单酶切位点对 PCR 产物进行酶切验证。酶切体系(2 0 L)：10 xQuick CutBuffer 2 L、PCR 产物 8 L、A p o l I1.5L、ddH208.5L。酶切程序：6 54h,8530 m i n。酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。1.7灵敏度分析用超微量分光光度计(NanoDrop2000c)将咖啡驼孢锈菌DNA初始浓度调整为10 ng/uL,采用浓度梯度稀释法将DNA进行10 0 10-6 倍的稀释，以10 0 为阳性对照,ddH2O为阴性对照,进行单管巢式PCR检测。扩增产物使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像引物名称PrimerHvF1HvR1HvF2HvR2特产表3咖啡驼孢锈菌的单管巢式PCR不同因素和水平L16(44)正交试验设计外引物/(pmol/L)Outer primer50.005.0010-35x10-45x10-1510-45.0010-30.50510-450.005.0010-35.0010-350.0050.005x10-40.500.50Table 4Single-tube nested PCR primers for H.vastatrix引物序列用途Primer sequenceUsageF:5-TTAACAATGGATCTCTTGGCTCTCAC-3第1轮扩增R:5-GATAATCAAAATAAAAAGAGAACAAGGGAC-3(外引物对）F:5-AGTGTTACTTTGCCTTTTTCTTT-3第2 轮扩增F:5-TGTCCCTTGTTCTCTTTTTATTT-3(内引物对)研究内引物/(mol/L)dNTPs/(mmol/L)Inner primer0.050.350.500.200.200.500.350.050.500.050.200.200.350.350.500.051.8疑似病样准备疑似咖啡叶锈病病叶样品采集自云南咖啡园，采用1.2 方法提取DNA,利用咖啡叶锈病菌的单管巢式PCR进行检测鉴定。2结果与分析2.1咖啡叶锈病菌单管巢式PCR引物设计将咖啡叶锈病菌ITS序列与下载自NCBI数据库中包括锈菌目同源序列于MultAlin网站上（http:/lmultalin.toulouse.inra.fr/multalin.html)进行多重比对。结果表明，咖啡叶锈病菌ITS序列与其他序列相比，除存有单碱基差异导致的多态性区域外，还存在明显的仅存在于咖啡叶锈病菌中的特异性区域。结合上述2类多态性区域设计了外引物对HvF1/HvR1 与内引物对HvF2/HvR2（表4)，二者预期扩增片段大小分别为 56 2 bp 和 37 1 bp。表4咖啡叶锈病菌单管巢式PCR引物2023年第45卷第5期rTaq/(5 U/uL)/U)0.103.000.107.000.109.000.105.000.403.000.203.000.503.000.507.000.505.000.405.000.509.000.207.000.409.000.205.000.407.000.209.00仪拍照保存。以HvF2/HvR2进行普通PCR灵敏度检测。片段大小/bpFragment size562371第5期2.2内外引物退火温度筛选对内引物HvF2/HvR2进行梯度退火温度PCR扩增，结果表明，在供试的8 个梯度退火温度中，内引物HvF2/HvR2在退火温度为52.0 6 0.8 时，均能扩增出目的条带，内引物在退火温度为52.0、52.8、56.2时，扩增出的条带较清晰，在退火温度为54.1、58.7条带稍弱；而在退火温度为6 0.8 时，仅扩增出一条微弱的条带，而退火温度高于此温度时不能扩增出任何条带，表明内引物的最大退火温度为6 0.8，见图1。据此，选取52 为内引物的退火温度，开展后续试验。bpMCK123456782.000500-250-注：M.DL2000标准分子量；CK.ddH20；1.52.;2.52.8；3.54.1；4.56.2;5.58.7;6.6 0.8;7.6 2.2;8.6 3。Note:M.DL2 000 DNA marker;CK.ddH20;1.52 C;2.52.8 C;3.54.1 C;4.56.2;5.58.7;6.6 0.8 ;7.6 2.2;8.6 3.图1咖啡叶锈病菌单管巢式PCR内引物HvF2/HvR2退火Fig.1 Optimization of the annealing temperature for inter-nal single-tube nested primers HvF2/HvR2 of H.vastatrix对外引物HvF1/R1进行梯度退火温度PCR扩增,结果表明，在设定的6 个外引物退火温度中，只有退火温度为6 0.0 6 4.5时能扩增出清晰的条带，而其余的4个退火温度均未扩增出任何条带，见图2。根据图1结果可知，内引物在退火温度为6 0.8 及其以上时，并不能有效扩增。也即只有外引物退火温度为60.8及其以上时，单管巢式PCR中外引物即可有效扩增，内引物由于退火温度过高而不能有效扩增。从图2 可看出，当退火温度为6 2.4与6 4.5时，均可扩增出清晰特异性条带，由此表明外引物的退火温度范围为6 2.4 6 4.5。为了后续试验操作方便，本研究选6 3作为HvF1/R1的退火温度。bpM CK123456782.000500250注：M.DL2000标准分子量；CK.ddH20；1.6 0；2.6 0.9；3.6 2.4；4.64.5;5.6 7.2;6.6 9.6;7.7 1.1;8.7 2。Note:M.DL2 000 DNA marker;CK.ddH20;1.60 C;2.60.9 C;3.62.4;4.64.5;5.6 7.2;6.6 9.6;7.7 1.1;8.7 2.图2 咖啡叶锈病菌单管巢式PCR外引物HvF1/R1退火温度优化Fig.2 Optimization of the annealing temperature of singletube nested PCR outer primers HvF1/R1 for H.vastatrix吴伟怀，等：咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立与应用温度优化52.3单管巢式PCR检测体系的优化根据正交实验设计的16 种试验组合进行巢式PCR扩增。试验结果表明，在16 种组合中，其中组合5、7、9、11、13均扩增出预期的单一条带，但组合13扩增条带最强；组合15虽然扩增条带比组合13的更强，但是该组合外引物也有少量扩增，见图3。由此筛选出组合13为最优组合。也即当外引物浓度为50 pM，内引物浓度为0.35mol/L,dNTPs浓度为0.4mmol/L,rTaq酶(5U/L)量为9U时,扩增条带既单一又清晰。综上所述，由此而建立的咖啡叶锈病菌单管巢式PCR最佳反应体系（2 0 L)为：10 rTaqBuffer2.5L，2.5 mmol/L dNTPs 3.2 L,rTaq DNA Polymerase(5 U/L)1.8 L,7 mol/L 的 HvF2/HvR2 引物各 1 L,1 nmol/L的 HvF1/HvR1 引物各 1L,模板 DNA 1L,ddH207.5L。M CK12345678910111213141516bp2.000500250注：1 16.正交试验的16 个组合（详见表3）。Note:116.16 combinations of orthogonal test(to see table 3 for details).图3单管巢式PCR正交试验16 种组合扩增效果比较Fig.3 Comparison of amplification effects of 16 combina-tions in single tube nested PCR orthogonal test2.4单管巢式PCR检测体系特异性分析特异性试验结果表明，只有DNA来自咖啡叶锈病菌时，电泳可见清晰且特异条带，而其它非咖啡叶锈病菌DNA,均未扩增出任何条带（图4)。同时，以咖啡叶锈病菌模板DNA为阳性对照,ddH2O为阴性对照，对扩增出的咖啡叶锈病菌PCR产物进行ApoLI单酶切验证，酶切产物电泳可见预期大小（136 bp）的目的条带（图5）。由此表明，所建立的咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系具有较好的特异性。bpM CK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 162000500250注：M.DL2000标准分子量；CK.ddH2O；1 2.咖啡驼孢锈菌；3 4.甘蔗黄锈菌；5.鸡蛋花鞘锈菌；6.葡萄层锈菌；7 8.甘蔗褐锈病菌；9 10.咖啡炭疽病菌；1112.咖啡褐斑病菌；13 14.咖啡腐皮镰孢黑果病菌；15.咖啡露湿拟漆斑菌；16.咖啡拟多盘毛孢叶斑病菌。Note:M.DL2 000 DNA marker;CK.ddH2O;2.12.H.vastatrix;34.P.kuehni;5.C.plumierae;6.P.ampelopsidis;7-8.P melanocephala;9-10.C.gloeosporioides;1112.C.coffeicola;13-14.F.solani;15.Pa.breviseta;16.P.trachicarpicola.图4咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系特异性分析Fig.4Specificity analysis of single-tube nested PCR fordetection of H.vastatrix6注：M.DL2000标准分子量；CK.ddH2O;1.PCR产物；2 3.酶切产物。Note:M.DL2 000 DNA marker;CK.ddH20;1.PCR products;23.digestionproducts.图5咖啡叶锈病菌单管巢式PCR产物酶切Fig.5 Digestion of single-tube nested PCR product of H.vastatrix2.5灵敏度分析单管巢式PCR灵敏度结果显示，当DNA模板浓度为10 ng/L、1n g/u L、10 0 p g/L时，扩增条带清晰可见；而当模板浓度为10 pg/uL、1p g/L、10 0 f g/L其扩增条带逐渐变弱；当模板浓度为10 0 fg/uL时，仅检测出一条微弱的条带；而当模板浓度大于此浓度时，检测不出任何目的条带。由此表明，所建立的咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系的最低检测模板浓度为10 0 fg/uL,最低检测终浓度为5fg/L（图6 A）。比较而言，普通PCR灵敏度结果显示，当DNA浓度为10 ng/L、1 ng/uL时,可见清晰的条带,当 DNA 浓度为 10 0 pg/uL、10pg/uL时，条带渐弱，当DNA浓度大于10 pg/L时，扩增不出任何条带。因此，普通PCR的最低检测浓度为10 pg/L,最低检测终浓度为0.5pg/L(图 6 B)。所以，本试验所开发的咖啡叶锈病菌单管巢式PCR反应体系的最低检测终浓度(5 fg/L)是普通PCR最低检测终浓度(0.5pg/uL)的10 0 倍，具有较高的灵敏性。bpM CK123456782.000500250bp2.000500250注:M.DL2000标准分子量;CK.ddH20;1.10ng/uL;2.1ng/uL;3.100pg/uL;4.10 pg/L;5.1 pg/L;6.100 fg/L;7.10 fg/L;8.1 fg/L。Note:M.DL2 000 DNA marker CK.ddH20;1.10 ng/uL;2.1 ng/uL;3.100 pg/L;4.10 pg/L;5.1 pg/L;6.100 fg/L;7.10 fg/L;8.1 fg/L.图6 咖啡叶锈病菌单管巢式PCR灵敏度检测Fig.6Sensitivity of single-tube nested PCR for H.vastatrix特产研bpM CK 1 2 32.000一500-250-100一A.单管巢式PCRSingle-tube nested PCRM CK12345678B.普通PCRConventional-PCR究2.6疑似病样检测鉴定对咖啡园采取的2 2 份疑似咖啡叶锈菌叶片DNA进行单管巢式PCR检测。结果显示，采集的2 2 份样品DNA，经检测均出现预期大小（37 1bp)条带，见表5。由此表明，采集的2 2 份样本中均含有咖啡驼孢锈菌。表5疑似咖啡叶锈病病样检测鉴定Table 5 Identification of suspected coffee leaf rust by singletube nested PCR疑似病样病样Suspected序号diseaseNo.sample1咖啡叶锈病2咖啡叶锈病3咖啡叶锈病4咖啡叶锈病5咖啡叶锈病6咖啡叶锈病7咖啡叶锈病8咖啡叶锈病9咖啡叶锈病10咖啡叶锈病11咖啡叶锈病12咖啡叶锈病13咖啡叶锈病14咖啡叶锈病15咖啡叶锈病16咖啡叶锈病17咖啡叶锈病18咖啡叶锈病19咖啡叶锈病20咖啡叶锈病21咖啡叶锈病22咖啡叶锈病注：“”表示检测出。Note:means detected.3讨论以PCR为基础的病原菌分子检测技术得以广泛应用的前提条件就是高质量的引物，常常利用特异性的引物实现对靶标病原菌的扩增，而非靶标病原菌扩增不出条带，或者非靶标病原菌虽可扩增出条带，但是其大小明显与靶标病原菌的不同，从而到达二者区分的目的。基于巢式 PCR衍生而来的单管巢式PCR技术同样如此。为此,在本研究中利用所获得的咖啡叶锈病菌 ITS 序列与 NCBI 数据库搜索比对,发现咖啡叶2023年第45卷第5期单管巢式寄主采集地来源CollectionHostsite小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南瑞丽小粒种CIFC7963云南思茅小粒种CIFC7963云南思茅小粒种CIFC7963云南思茅小粒种CIFC7963云南思茅小粒种CIFC7963云南思茅小粒种CIFC7963云南思茅小粒种CIFC7963云南思茅PCR检测Single-tubenested PCRdetection第5期锈病菌ITS2 区域与其它非咖啡叶锈病菌存在特异区域。基于该特异性区域，结合单管巢式PCR引物设计原则中外引物对与内引物对退火温度的要求，最终设计了巢式PCR嵌套式引物对HvF1/R1与HvF2/R2,二者退火温度预期相差15。经NCBIdatabase搜索比对表明，引物对均具有较高的特异性。进一步通过对所设计的外引物对与内引物对的最佳退火温度进行了筛选与验证。最终筛选出咖啡叶锈病菌单管巢式PCR分子检测技术外、内引物的退火温度分别为6 3、52，二者相差达11。这已满足了单管巢式PCR检测技术基本要求之一，即外引物的退火温度必须高于内引物的退火温度10 以上16 。为了获得本研究中内外引物组的最优引物量之比，为此利用SPSS软件对外HvF1/HvR1、内引物浓度HvF2/HvR2,dNTPs浓度，rTaq酶量等体系关键因素进行正交实验设计。根据正交实验设计的16 种试验组合进行巢式PCR扩增。结果表明，在16 种组成中，只有组合13扩增条带单一且清晰。也即当外引物浓度为50 pM,内引物浓度为0.35mol/L,dNTPs浓度为0.4mmol/L,rTaq(5U/L)酶量为9U时，反应条带最特异、清晰（图4）。这一引物浓度之比，与已报道的母羊胎儿组织勾形虫（Toxoplasmagondli)外内引物终浓度比例(0.0 1M:0.4M)17、谷物样品镰刀病菌(F.culmorum)外内引物终浓度比(0.1fM:1 pM)18、菠萝凋萎病菌(Pineapplemealybugwilt)外内引物浓度比(2 pM:0.2nM)16、猫屎胎三毛滴虫（Tritrichomonasfoetus)外内引物浓度比(12.5 fM:0.25pM)19存在一定的差异，可能是由于内外引物的不同所导致的。所建立的检测体系只能从咖啡叶锈病菌中检测出目的条带，其它所有非咖啡叶锈病菌的模板DNA没有产生任何条带，这与汪涵等8 研究结果一致。灵敏度方面可达5fg/L,这一结果与检测结核性脑膜炎(Tub-erculous meningitis)20、与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的灵敏度2 1 要稍微弱点,二者的灵敏度均为1 fg/uL;但又明显比检测菠萝调萎病菌