晶状体蛋白截短导致先天性白内障的两个家系致病基因分析.pdf

临床分析晶状体蛋白截短导致先天性白内障的两个家系致病基因分析杨振菲佘重阳李乾国家康复辅具研究中心附属康复医院(北京,);首都医科大学附属北京朝阳医院;国家卫生健康委科学技术研究所,国家人类遗传资源中心摘要目的:通过使用全基因组外显子测序确定两个先天性白内障家系的致病基因变异.方法:对 年在首都医科大学附属北京同仁医院就诊的个先天性白内障家系部分成员进行详细的临床眼科检查及全身查体.采集先证者及亲属外周血并提取基因组D NA,应用全外显子测序筛查可疑致病基因,并对家系全部成员进行S a n g e r测序验证候选致病变异位点.结果:经过外显子测序及生物信息学分析,家系中在C R Y B B 基因中存在无义变异c GA,造成B 晶状体蛋白质第 位色氨酸变异为终止密码子(p W X),最终产生晶状体蛋白截短.家系中的发现在C R Y G D基因中存在无义变异c CT,造成 D晶状体蛋白质第 位谷氨酰胺变异为终止密码子(p Q X),导致晶状体蛋白截短.结论:位于C R Y B B 基因的无义变异c GA是导致家系出现先天性白内障的病因;位于C R Y G D基因的无义变异c CT是导致家系出现先天性白内障的病因.关键词先天性白内障;晶状体蛋白C R Y B B;晶状体蛋白C R Y G D;错义变异;蛋白截短A n a l y s i so fp a t h o g e n i cg e n e s i nt w o f a m i l i e sw i t hc o n g e n i t a l c a t a r a c t c a u s e db yp r o t e i nt r u n c a t i o nYAN GZ h e n f e i,S HEC h o n g y a n g,L IQ i a nR e h a b i l i t a t i o nH o s p i t a l,N a t i o n a lR e s e a r c hC e n t e rf o rR e h a b i l i t a t i o nT e c h n i c a lA i d s,B e i j i n g,;B e i j i n gC h a oY a n gH o s p i t a l,C a p i t a lM e d i c a lU n i v e r s i t y;N a t i o n a lR e s e a r c hI n s t i t u t e f o rF a m i l yP l a n n i n gA b s t r a c t O b j e c t i v e:T o i d e n t i f yv i r u l e n c eg e n o v a r i a t i o ni nt w of a m i l i e sw i t hc o n g e n i t a l c a t a r a c tb ye x o ns e q u e n c i n g M e t h o d s:T h ed e t a i l e dc l i n i c a l o p h t h a l m i ce x a m i n a t i o na n dt h eg e n e r a lp h y s i c a le x a m i n a t i o nw e r ep e r f o r m e di ns o m em e m b e r so f f a m i l i e sw i t hc o n g e n i t a l c a t a r a c tw h ow e r e t r e a t e d i nB e i j i n gT o n g r e nH o s p i t a l,C a p i t a lM e d i c a lU n i v e r s i t yf r o m t o T h ep e r i p h e r a l b l o o do f t h ep r o b a n d s a n d t h e i r r e l a t i v e sw a s c o l l e c t e d f o r e x t r a c t i n g t h eg e n o m i cD NA W h o l e e x o ns e q u e n c i n gw a su s e d t o s c r e e n t h e s u s p e c t e dp a t h o g e n i cg e n e s,a n dS a n g e r s e q u e n c i n gw a su s e d t ov e r i f yt h ec a n d i d a t ep a t h o g e n i cm u t a t i o ns i t e so f a l l t h e f a m i l ym e m b e r s R e s u l t s:E x o ns e q u e n c i n ga n db i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i ss h o w e dt h a t t h e r ew a sn o n s e n s em u t a t i o no f c GAi nC R Y B B g e n e i nf a m i l y,w h i c hc a u s e dt h e t r y p t o p h a nm u t a t i o na tp o s i t i o n o fC R Y B B t ob e c o m et h et e r m i n a t i o nc o d o n(p W X),a n df i n a l l yp r o d u c e dt h et r u n c a t e dc r y s t a l l i n I n f a m i l y,t h en o n s e n s em u t a t i o no f c CTi nC R Y G Dg e n e c a u s e dt h e t r y p t o p h a nm u t a t i o na tp o s i t i o na t t h e t hp o s i t i o no fC R Y G Dt ob e c o m ea t e r m i n a t i o nc o d o n(p Q X),a n dw h i c h f i n a l l yp r o d u c e dt h et r u n c a t e dc r y s t a l l i n C o n c l u s i o n:T h en o n s e n s em u t a t i o no f c GAi nC R Y B B g e n e i s t h eg e n e t i c c a u s eo f c o n g e n i t a l c a t a r a c t i nf a m i l y T h en o n s e n s em u t a t i o no f c CTi nC R Y G Dg e n e i st h eg e n e t i cc a u s eo fc o n g e n i t a l c a t a r a c t i nf a m i l yK e yw o r d s C o n g e n i t a l c a t a r a c t;C r y s t a l l i nC R Y B B;C r y s t a l l i nC R Y G D;N o n s e n s em u t a t i o n;P r o t e i nt r u n c a t i o n先天性白内障指出生前即存在或出生后年内逐渐形成的晶状体部分或全部混浊,是儿童失明主D O I:/j i s s n 收稿日期:修回日期:通信作者:l i q i a n_g e n e c o m要原因之一.在世界范围内,先天性白内障患病率在/.先天性白内障可作为孤立的疾病单独发生,但也可伴有其它眼部病变,包括弱视、斜视、小角膜和无虹膜症等 .据估计,/的先天性白内障患者具有明显的遗传特征,其中常染色体显性遗传为最常见的遗传方式,常染色中国计划生育学杂志 年月 第 卷 第期C h i nJF a mP l a n n,V o l ,N o ,A u g u s t 体隐性遗传以及X连锁隐性遗传也在一些家系中被报道.近年来,随着高通量测序技术的不断发展和普及,越来越多与先天性白内障相关的致病基因被发现.通过查询人类疾病变异数据库,目前已发现 余个基因与先天性白内障有关,这些基因大都涉及到晶状体蛋白、膜蛋白、转录因子、细胞骨架蛋白的表达从而影响到晶状体在胚胎时期的发育,导致新生儿出现先天性白内障 .本研究采用全外显子测序对个先天性白内障家系进行全基因组外显子测序,使用S a n g e r测序验证可疑致病风险位点,并应用生物信息学手段对这些变异位点做了结构功能的预测,并探讨这个先天性白内障发病的遗传学基础 .对象与方法研究对象对 年在首都医科大学附属北京同仁医院眼科就诊的个先天性白内障家系进行临床眼科检查和全身查体,详细询问家族史,收集疾病发病和症状信息,绘制系谱图.所有参与研究的家系成员均签署知情同意书,本研究经首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会批准.临床检查对家系中所有成员进行了详细的眼科检查.采用裂隙灯显微镜进行眼前节检查,眼压计(i c a r e)测量眼压,彩色眼底相机进行眼底检查,光学相干生物测量仪测量眼轴、采用眼科A/B超声诊断仪观察玻璃体/视网膜的情况.对家系中所有成员进行全身查体,以排查伴有其他系统疾病.外显子测序及生物信息学分析使用Q i a g e n全血D NA提取试剂盒提取基因组D NA,先症者基因组D NA进行全外显子测序.外显子文库使用A g i l e n tS u r e S e l e c tH u m a n A l lE x o nV k i t(A g i l e n tT e c h n o l o g i e s,P a l o A l t o,C A,U S A)进行捕获.外显子文库使用N o v a S e q 高通量测序系统(I l l u m i n a,S a nD i e g o,C A,U S A)进行P E 测序,数据量至少为 G b.利用B u r r o w s Wh e e l e rA l i g n e r软件将r e a d s比对到h g 人类基因组(U C S Ch u m a ng e n o m eh g b u i l d)/G R C h .使用S a m t o o l s识别单核苷酸变异(S NV s)和插入删除变异(I N D E L s).使用ANNOVA R对变异信息进行注释.将变异数据比对到d b S N P数据库(h t t p s:/wwwn c b i n l mn i hg o v/s n p)、千人基因组计 划 数 据 库(h t t p:/www g e n o m e s o r g)、OM I M数据库(h t t p s:/o m i mo r g/)以及人类基因变异数据库(h t t p:/wwwh g m d c f a c u k/)并筛选可疑变异.结果家系来自河北省,连续代都有白内障患者,具有典型的常染色体显性遗传特点,此家系共收集到血样份,其中患者份,正常成员份(图,页).该家系的临床特点:先证者是名 岁男性,岁时被诊断为双侧白内障,裂隙灯检查结果为核性白内障(图,页),伴眼球震颤,眼部检查无畸形,无上睑下垂等,最佳矫正视力为/.对先证者进行了外显子测序,并对变异数据筛选,过滤去除千人基因组计划数据库中等位基因频率 以及对蛋白质没有影响的变异.将剩下的存在变异的基因在OM I M数据库与白内障相关的致病基因匹配,最终在先证者C R Y B B 基因编码区核苷酸 位出现一个杂合型GA颠换(c GA).在所有家系成员中进行了该位点P C R扩增和S a n g e r测序,S a n g e r测序的结果显示家系中所有患者均携带有该变异,同时家系中表型正常的家人无检出此变异,符合基因表型共分离(图,页).家族成员测序结果显示这个变异只在患者中出现,正常人中未出现,该变异在家系内与疾病表型共分离.根据美国医学遗传学与基因组学学会(A CMG)关于遗传变异分类标准,符合家系内共分离证据P P.同时将变异数据比对到d b S N P数据库千人基因组计划数据库、OM I M数据库,未发现此位点,符合A CMG指南关于人群中出现频率的证据PM.此 外 人 类 基 因 变 异 数 据 库(h t t p:/wwwh g m d c f a c u k/)未发现该变异收录.对 蛋 白 质 的 序 列 分 析 发 现 此 变 异 导 致C R Y B B 基因编码的蛋白第 位氨基酸由色氨酸替换为终止密码子(p W X),截短了 个氨基酸,最终产生个提前终止的截短晶状体蛋白(图,页),符合A CMG指南编码蛋白长度改变的证据PM.利用N C B I基因数据库对该变异位点氨基酸序列的保守性进行分析,结果显示此位点在各 物 种 具 有 高 度 保 守 性,且 该 变 异 位 点 位 于中国计划生育学杂志 年月 第 卷 第期C h i nJF a mP l a n n,V o l ,N o ,A u g u s t C R Y B B 基因的第个G r e e K K e y结构域中,是变异的热点区域(图,页),该区域变异多为截短蛋白型变异,对应的临床表型比较严重,符合A C MG指南变异证据PM.综上所述,根据A CMG指南变异判断准则,该变异位点致病性判定为可能致病(l i k e l yp a t h o g e n i c),证据为PM PM PM P P.家系来自吉林省,家族中连续代都见白内障患者,具有典型的常染色体显性遗传特点,此家系共收集到血样 份,其中患者份,正常成员份(图,页).该家系的临床特点:家系中患病都患有双眼晶状体浑浊,多数患者在岁时视敏度开始下降.先证者是名岁女孩,岁时发现视敏度下降,诊断为双眼先天性白内障,裂隙灯检查结果为先天性核性白内障(图,页),眼部检查无畸形,无上睑下垂,无眼球震颤等,最佳矫正视力为/.眼部检查无畸形,无上睑下垂,无眼球震颤等.对家系先证者进行了外显子测序,然后对外显子变异数据进行筛选,过滤去除千人基因组计划数据库中等位基因频率 以及对蛋白质没有影 响 的 变 异.将 剩 下 的 存 在 变 异 的 基 因 在OM I M数据库与白内障相关的致病基因匹配,最终在先证者C R Y G D基因编码区核苷酸 位出现一个杂合型CT颠换(c CT)(图,页).这个颠换导致C R Y G D基因编码的蛋白第 位氨基酸由谷氨酰胺替换为终止密码子(p Q X),蛋白质截断了 个氨基酸(图,页),符合A C MG指 南 编 码 蛋 白 长 度 改 变 的 证 据PM.利 用N C B I基因数据库对该变异位点氨基酸序列的保守性进行分析,结果显示此位点在各物种具有高度保守性,且该变异位点位于C R Y G D基因的第个G r e e K K e y结构域中,是变异的热点区域且所有变异对应的临床表型比较严重,符合A CMG指南证据PM.家族成员测序结果显示这个变异只在患者中出现,正常人中未出现,该变异在家系内与疾病表型共分离,符合A CMG指南家系内共分离证据P P.同时将变异数据比对到d b S N P数据库千人基因组计划数据库、OM I M数据库,符合A CMG指南关于人群中出现频率的证据PM.此外HGMD数据库未发现该变异收录变异.综上所述,根据A CMG指南变异判断准则,该变异位点致病性判定为可能致病(l i k e l yp a t h o g e n i c),证据为PM PM PM P P.讨论先天性白内障病因多而复杂,其中遗传因素是最重要的原因之一.目前,国内外在先天性白内障致病基因鉴定方面已取得了重大进展,采用全基因组扫描与连锁分析的方法已发现与先天性白内障相关的基因位点有 余个,通过位置候选克隆及全基因组外显子测序技术鉴定了至少 个致病基因.本文发现的两个变异位点都是导致了晶状体蛋白截断,在遗传学上,截短蛋白对蛋白质的生物学影响是比较严重的.根据美国医学遗传学与基因组学学会(A CMG)关于遗传变异分类标准与指南判断准则,C R Y B B 基因c GA是导致家系白内障发生的变异基因位点,C R Y G D基因c CT(p G l n T e r)是导致家系白内障发生的变异基因位点.家系中 发 现 的 无 义 变 异 位 点c GA(W X)位于C R Y B B 基因,C R Y B B 基因编码B 晶状体蛋白质,B 晶状体蛋白质由 个氨基酸组成,其主要在晶状体核表达.B 晶状体蛋白质由一个NH 端,个G r e e K K e y结构,一个C OOH端组成.B 晶状体蛋白质是晶状体蛋白质的主要亚单位,占人类晶状体中可溶性结晶蛋白总量的,对保持晶状体透明度很重要.B 晶状体蛋白质长期以来一直被认为与晶状体中的酸性晶状体蛋白形成异构体的关键蛋白,而这些异构体的形成被认为对保持晶状体的透明度非常重要,因此B 晶状体蛋白质异常可能会引起白内障的发生 .迄今为止,在先天性白内障和一些其他发育性眼部异常的家庭中,在C R Y B B 基因至少发现了 个变 异(图,页),其 中个 变 异 位 于C R Y B B 基因的第个结构域中,这表明编码第个结构域的第个外显子是变异的热点.研究表明靠近C OOH末端的变异会诱导更严重的表型,这可能归因于B 晶状体蛋白质的溶解度和稳定性收到了干扰.本研究中描述的家系中p W X变异位于C R Y B B 蛋白第个结构域,会导致编码蛋白提前终止,将B 晶状体蛋白截断 个氨基酸.蛋白变短降低了B 蛋白的稳定性,从而导致中国计划生育学杂志 年月 第 卷 第期C h i nJF a mP l a n n,V o l ,N o ,A u g u s t 先天性白内障.家系中 发 现 的 无 义 变 异c CT(p Q X)位于C R Y G D基因,是一个无义变异造成C R Y G D第 位谷氨酰胺变异为终止密码子,最终产生一个提前终止的截短蛋白.C R Y G D基因编码一个由 个氨基酸组成的蛋白质(D 晶状体蛋白质),占人类晶状体总晶体蛋白的,其在纤维细胞中的高表达形成了胚胎晶状体核.D 晶状体蛋白质由一个NH 端,个G r e e K K e y结构,一个C OOH端组成.目前发现C R Y G D基因变异位点约 个(图,页),可导致不同类型的先天性白内障.研究中的c CT变 异 位 于C R Y G D蛋 白 的GKM 中,截 短 了 个 氨 基 酸,导 致GKM 和C OOH末端残基的缺失.既往研究表明,C R Y G D蛋白的C OOH末端残基在溶解度和分子间相互作用中起着重要作用,疏水相互作用的干扰和疏水表面暴露的增加可能导致晶状体蛋白的聚集和透明度的损失,最终导致先天性白内障的发生.综上,本文在个中国人先天性白内障家系中的C R Y B B 基因中发现了个新的变异位点,这两个变异都导致氨基酸变成终止密码子,导致晶状体蛋白截短,C OOH末端缺失.截短的晶状体蛋白可能通过改变晶状体蛋白的结构、改变晶体疏水性以及稳定性而导致先天性白内障.本研究进一步证实了晶状体蛋白截短会严重晶状体的稳定性,也验证了晶状体蛋白C OOH末端在保持晶状体透明性方面的重要性,这为人类先天性白内障发病机制的分子机制提供了新的实验依据.参考文献B r e m o n d G i g n a cD,D a r u i c hA,R o b e r tMP,e t a l R e c e n td e v e l o p m e n t s i nt h em a n a g e m e n to f c o n g e n i t a l c a t a r a c tJ A n nT r a n s lM e d,():L i J,C h e nX,Y a nY,e ta l M o l e c u l a rg e n e t i c so fc o n g e n i t a lc a t a r a c t sJ E x pE y eR e s,:L i n M,J i n Y,C h e nX,e ta l I n c r e a s e dh y d r o p h o b i c i t yo fC R Y G Dp(A l a P r o f s T e r):S u s p e c t e dc a u s eo fc o n g e n i t a lc a t a r a c t si nal a r g eC h i n e s ef a m i l yJM o lG e n e tG e n o m i cM e d,():e C a i S P,L uL,W a n gX Z,e t a l Am u t a t e dC R Y G Da s s o c i a t e dw i t hc o n g e n i t a l c o r a l l i f o r mc a t a r a c t s i nt w oC h i n e s ep e d i g r e e sJ I n t JO p h t h a l m o l,():S h i e l sA,B e n n e t tTM,H e j t m a n c i kJ F C a t M a p:p u t t i n gc a t a r a c to nt h em a pJ M o lV i s,:K a n d a s w a m yD K,P r a k a s h MV S,G r a wJ,e ta l A p p l i c a t i o no fWE ST o w a r d sM o l e c u l a rI n v e s t i g a t i o no fC o n g e n i t a lC a t a r a c t s:I d e n t i f i c a t i o no fN o v e lA l l e l e sa n dG e n e s i naH o s p i t a l B a s e dC o h o r to fS o u t hI n d i aJ I n t JM o l S c i,():G i l l e s p i eR L,U r q u h a r t J,A n d e r s o nB,e t a l N e x t g e n e r a t i o nS e q u e n c i n g i nt h eD i a g n o s i so fM e t a b o l i cD i s e a s e M a r k e db yP e d i a t r i cC a t a r a c tJ O p h t h a l m o l o g y,():T a y l a nS e k e r o g l u H,U t i n eG E C o n g e n i t a lC a t a r a c ta n dI t sG e n e t i c s:T h eE r ao fN e x t G e n e r a t i o nS e q u e n c i n gJ T u r kJO p h t h a l m o l,():M e s s i n a B a a sO,C u e v a s C o v a r r u b i a sS A I n h e r i t e dC o n g e n i t a lC a t a r a c t:AG u i d e t oS u s p e c t t h eG e n e t i cE t i o l o g y i n t h eC a t a r a c tG e n e s i sJ M o lS y n d r o m o l,():Y uY,Q i a oY,Y eY,e ta l I d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f s i x c r y s t a l l i ng e n em u t a t i o n s a s s o c i a t e dw i t hc o n g e n i t a l c a t a r a c t i nC h i n e s e f a m i l i e sJ M o lG e n e tG e n o m i cM e d,():e B e r r yV,I o n i d e sA,P o n t i k o sN,e t a l T h eg e n e t i c l a n d s c a p eo f c r y s t a l l i n s i nc o n g e n i t a l c a t a r a c tJ O r p h a n e t JR a r eD i s,():J i nA,Z h a n gY,X i a oD,e ta l AN o v e lM u t a t i o np S Ri nC R Y B B A s s o c i a t e dw i t hD o m i n a n tC o n g e n i t a lC a t a r a c ta n dM i c r o p h t h a l m i aJ C u r rE y eR e s,():J iY,Z h a oX,Z h a n gJ,e ta l An o v e lm i s s e n s em u t a t i o no fC R Y B B c a u s e sc o n g e n i t a lc a t a r a c ti naC h i n e s ef a m i l yJE u r JO p h t h a l m o l,():R a oY,D o n gS,L iZ,e ta l An o v e l t r u n c a t i o nm u t a t i o ni nC R Y B B a s s o c i a t e dw i t ha u t o s o m a l d o m i n a n t c o n g e n i t a l c a t a r a c tw i t hn y s t a g m u sJ M o lV i s,:G a oY,R e nX,F uX,e t a l C a s eR e p o r t:AN o v e lM u t a t i o ni nt h eC R Y G DG e n eC a u s i n gC o n g e n i t a lC a t a r a c tA s s o c i a t e dw i t hN y s t a g m u s i naC h i n e s eF a m i l yJ F r o n tG e n e t,:责任编辑:张璐中国计划生育学杂志 年月 第 卷 第期C h i nJF a mP l a n n,V o l ,N o ,A u g u s t