精神分裂症患者血浆外泌体微小RNA差异表达谱及其生物信息学分析.pdf

论著精神分裂症患者血浆外泌体微小差异表达谱及其生物信息学分析梁静文，余卓恒，刘宜欢，叶彩虹，许瑞环 摘要：目的：探讨精神分裂症患者及正常人群血浆外泌体微小（）的差异表达，初步了解差异表达在精神分裂症病程发展中的作用。方法：采用高通量测序技术检测例精神分裂症患者和名健康对照者的血浆外泌体的表达水平，构建差异表达谱。预测表达差异显著的的靶基因，再对靶基因进行功能注释和通路分析，确定差异表达的主要生物学功能及其可能参与的信号通路。结果：与对照组相比，精神分裂症患者血浆外泌体共筛选出个显著异常表达，其中个表达上调，个表达下调。通过富集和分析，上述差异表达的主要涉及神经元细胞体、谷氨酸能突触、神经元间突触、突触前和突触膜等细胞组成，并主要参与轴突新生、化学突触传递调节、跨突触信号调节等生物过程，可能通过信号通路、信号通路、信号通路、信号通路、信号通路、多巴胺能突触及等信号通路参与精神分裂症的发生和发展过程。结论：经药治疗精神分裂症患者血浆外泌体中存在显著的差异性表达，、等可能通过信号通路、信号通路等在精神分裂症的发生发展过程中发挥重要作用。关键词：精神分裂症；血浆；外泌体；微小；生物信息学分析中图分类号：文献标识码：文章编号：（），：，：，（）（），：，：，：；基金项目：深圳市龙岗区年度医疗卫生科技计划项目（）作者单位：深圳市龙岗中心医院检验科（梁静文）；北京中医药大学深圳医院（龙岗）（余卓恒）；深圳市康宁医院检验科（刘宜欢，叶彩虹）；香港中文大学（深圳）附属第二医院（许瑞环）通信作者：余卓恒，：精神分裂症是高致残、高致死性的重性精神障碍之一，其发生发展涉及遗传因素、环境因素、大脑实质改变等多个因素。其发病机制仍不清楚，临床上缺乏客观诊断和治疗监测的实验室指标。因此，寻找精神分裂症客观的生物标志物，对获取临床诊 ，断及治疗的客观标准有很大的帮助。近年来，越来越多的证据表明微小（）在神经分化、突触可塑性和认知功能等神经发育方面发挥关键作用。与健康人群相比，阿尔茨海默症、精神分裂症、抑郁症等患者的表达存在差异，这些研究结果提示可作为各种神经精神疾病的潜在生物标志物。外泌体是一种直径为 的脂质小囊泡，可释放外泌体的细胞种类繁多。外泌体能够传递多种信号分子，如蛋白质、信使（）和。是外泌体的关键功能原件，可通过抑制或促进靶基因的表达来影响细胞生物学功能，甚至可能参与调控这些靶基因涉及的所有细胞通路。因此，外泌体也被认为是疾病进展、药物治疗监测、疾病预后等潜在的生物学标志物，但关于精神分裂症的外泌体的研究非常有限。为此，本研究拟采用高通量测序技术筛选出经药治疗精神分裂症发病期患者血浆外泌体差异表达的，并采用软件、数据库对差异表达进行靶基因预测、分析和通路预测，初步了解差异表达的功能，为研究精神分裂症的发病机制提供新的思路。对象和方法 对象精神分裂症组来自深圳市康宁医院在年月至年月收治住院的精神分裂症患者例，主要经抗精神病药氯氮平系统治疗年，病程年，其中男例，女例，年龄 岁，平均（）岁。纳入标准：符合美国精神障碍诊断和统计手册第版 精神分裂症的诊断标准，由名精神科医生（至少名医生为副主任医师以上职称）诊断一致；排除脑器质性和躯体其他疾病所致的精神障碍、其他精神疾病、有酗酒和药物滥用史者。健康对照组选择同期在深圳市龙岗中心医院的名正常志愿者，其中男名，女名；年龄 岁，平均（）岁。纳入标准：由名精神科医师单独进行访谈并排除精神类疾病；无精神病家族史；未服用与精神病相关的任何药物；年龄、性别分别与患者匹配。本研究方案获得深圳市龙岗中心医院伦理委员会审批通过。方法 血浆样本的收集将采集的全血置于含抗凝管，混匀，然后以 ，离心，取上清即为血浆，再 ，离心，最后将得到的血浆分装到 的管内，于 低温冰箱冷冻储存。血浆外泌体的提取血浆外泌体的分离按照 （）试剂盒的说明书进行。首先将血浆样本从低温环境中取出，室温离心，以去除残留细胞及碎片，转移上清至新管，室温离心，转移上清至新管，加入体积的 （），完全混匀样本，放入 冰箱静置，离心，用移液器小心吸去上清，离心获得的沉淀，即为外泌体样本。外泌体高通量测序外泌体抽提按照核酸提取试剂盒（）说明书的方案一进行。同时，采用检测样品浓度，检测样品分布范围。质检结果合格后，将提取血浆外泌体的总按照 试剂盒说明书构建文库，主要步骤为：提取的片段纯化后，连接 端和的接头，反转录呈，再进行扩增。随后切胶回收目的的片段文库，用 进 行 文 库 质 检，最 后 用测序仪运行模式进行测序。测序所得的原始数据，首先进行过滤：取出两端的接头，取出片段长队 的和低质量的等，完成数据的初步过滤并获得高质量数据。我们将过滤得到的与权威 数据库进行比对，进而注释出已知的，包括、。外泌体的差异表达分析本研究通过与 数据库对成熟体序列进行比对，并计算的表达量。差异分析采用程序包对正常志愿者和精神分裂症患者之间的差异表达水平进行统计学分析，通过差异倍数（）和显著水平（）两个水平筛选差异表达。靶基因的预测以及功能分析本研究采用、四个软件对差异表达的进行靶基因预测，同时对四个软件的预测结果进行进一步筛选整理，并以预测结果或者同时为、三个软件的预测结果作为外泌体的候选靶基因。通过超几何分布方法等统计学分析对靶基因进行分析，以注释富集程度的 临床精神医学杂志年第卷第期 为显著阈值，分析结果显示基因主要涉及细胞组成、分子功能以及生物过程三个方面。对的靶基因进行分析，通过 计算值以通路富集程度的 为显著性阈值，得到分析结果。结果 非编码（）注释与分类所有精神分裂症标本与正常志愿者标本测序得到的与各类权威数据库进行比对及注释，具体使用的数据库如下：数据库来自 ；、数据库来自；数据库来自，并对结果进行统计及制图。数据显示，精神分裂症组的比例比正常对照组的高。其平均占比达。外泌体差异表达的筛选本实验筛选出样品间的差异表达（，）共个，其中个上调，个下调。我们通过绘制火山图，图中红色圆点表示有显著性上调，绿色圆点表示显著下调。见表，见表，见图。表两组部分上调表达的外泌体分子比较（珋）组（）对照组（）基因表达差异倍数值 表部分下调表达的外泌体分子 组（）对照组（）基因表达差异倍数值 图外泌体基因表达差异倍数（）火山图注：红色圆点为有显著上调，绿色圆点为显著下调 差异表达外泌体的生物信息学分析基因主要参与轴突生成、化学突触传递调节、跨突出信号的调节等生物过程，涉及神经元细胞体、谷氨酸能突触、神经元间突触、突触前和突触膜等细胞组成。通路分析显示，主要参与多巴胺能突触、信号通路、信号通路、信号通路等与精神分裂症相关的信号通路。见表。讨论本研究对比经药治疗精神分裂症患者和健康人群血浆外泌体中差异表达的，经测序平台分析两组的血浆外泌体表达谱，共筛选出个显著差异表达，其中个表达上调，个表达下调。这一数据说明，经药治疗精神分裂症患者的血浆外泌体表达谱较健康人群仍存在显著的变化。，表部分差异表达外泌体靶向相关的通路 信号通路信号通路信号通路信号通路信号通路信号通路多巴胺信号通路 我们对差异表达的进行靶基因筛选，发现部分差异表达的能靶向精神分裂症相关基因，与精神分裂症病程发展有着紧密的联系。进一步对靶基因进行分析，结果显示基因主要定位神经元细胞体、谷氨酸能突触、神经元间突触、突触前和突触膜，主要涉及轴突新生、化学突触传递调节、跨突触信号调节等生物过程，这些证据提示，这些差异表达的在突触功能及神经元活动的调控中起重要作用。等通过分析例精神分裂症患者、名亲属和名健康对照的脑电图数据，发现精神分裂症异常的脑电图是由突触形成减少造成的，这意味着精神分裂症相关症状很有可能是因为突触功能的中断，或神经元之间的交流方式异常，进而使兴奋性和抑制性传递之间的不平衡导致的。本研究中，经药治疗精神分裂症组表达量明显高于健康人群组，这些差异表达的很有可能导致基因转录水平的紊乱，进而影响突触功能甚至是导致神经元之间的信号传递异常，从而参与精神分裂症的病程发展。本研究分析结果显示，富集显著的通路主要为、和多巴胺能突触等在多种神经系统疾病的发病发展过程中起关键作用的信号通路。其中，、等条信号通路均被报道其通过不同的生物过程激活蛋白，参与介导神经元的损伤、凋亡。家族还受 信号通路的调控，参与调控细胞周期、分化、代谢和凋亡等重要生命过程，还可以调节下游靶基因的表达。这与精神分裂症存在凋亡通路的异常，导致神经元和神经胶质细胞的凋亡活动发生改变的观点一致。本研究对差异表达的外泌体靶基因进行预测发现，作为关键，共同调控靶基因参与、等信号通路，并对脑源性神经营养因子（，）的表达存在靶向调控作用。是神经元生长必不可少的神经营养因子之一，与结合能够促进神经元存活与发育，并能够抑制或缓解神经元受损死亡。近年来国内外研究均发现与精神分裂症的临床症状有一定的关联性，低于正常人水平表达的可能会引起神经发育障碍进而引发精神分裂症。近期，李志远教授团队证实了靶向并负调控表达。等的研究发现首发精神分裂症患者全血外泌体表达上调最显著，其对应的血浆表达亦显著下降。本研究发现经药治疗后的精神分裂症发病期患者血浆外泌体表达亦显著上调，这一发现说明，外泌体很有可能与精神分裂症的发病相关。综合上述数据，我们推测上调的很有可能通过干扰基因表达，导致的功能失调，加速神经可塑性受损、神经元细胞丢失甚至死亡，从而导致患者出现认知障碍等相关临床症状，这一推测与目前精神分裂症的神经营养素假说一致，很有可能成为精神分裂症的发病机制中的一个新的信号通路。在经药治疗精神分裂症组，、等关键调控关键靶基因参与、多巴胺能突触等与神经系统疾病相关的通路，并对神经调节素（）的表达存在靶向调控作用。是多种细胞损伤的保护因子，有研究发现癫痫大鼠神经细胞中的临床精神医学杂志年第卷第期表达水平显著升高，干扰的表达后癫痫大鼠神经细胞抗氧化系统酶类升高，氧化系统酶类含量降低，这一数据提示高表达很有可能通过促进神经细胞氧化应激反应而使神经元损伤。是神经干细胞增殖和神经分化的负调控因子。有研究团队将重度抑郁症患者的血液外泌体注射到小鼠的尾静脉，发现小鼠产生了明显的抑郁样行为，相反，将健康人群的血液外泌体注射到有抑郁样行为的小鼠体内，发现小鼠的抑郁样症状有所减轻，这一研究结果提示水平的上调可能介导应急诱导抑郁样行为的产生。本研究发现精神分裂症患者血浆外泌体和表达显著上调，它们很可能同时对精神分裂症相关基因存在靶向调控作用。是精神分裂症的易感基因，丛启杰等通过脑立体定位注射技术对小鼠大脑前额皮质进行基因敲除，发现小鼠出现自发活动量增加、焦虑为特征的精神分裂症样行为。我们猜测和水平上调，很有可能抑制患者的表达水平，从而导致抑制性和兴奋性神经递质转运蛋白平衡失调，结果尚需进一步验证。本研究结果还显示，在精神分裂症样本中表达下调，根据靶基因预测，发现其可能对结蹄组织生长因子（）的表达存在靶向作用。研究发现，中脑多巴胺能神经元可特异性表达，反映其在中脑多巴胺能神经元的成熟、功能和存活起着重要作用。研究人员等利用大鼠的动物实验结果发现，的上调可负反馈的表达水平，从而抑制抑郁大鼠海马神经元凋亡，抑制炎症反应，保护抑郁大鼠海马神经元免于凋亡和炎症的损伤。本研究发现经药治疗精神分裂症发病期患者水平下调，与之间很有可能存在一个负反馈调控网络，导致神经元在细胞凋亡机制和炎症机制的作用下受损甚至凋亡。综上，本研究发现经药治疗精神分裂症患者和正常人群血浆外泌体表达仍存在显著差异。精神分裂症患者血浆外泌体表达的、等可能是精神分裂症发生发展潜在的诊断生物标记物，这对进一步认识在精神分裂症发病机制的作用具有一定的参考意义。参考文献：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（），：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：赵利，李海燕 对癫痫发作后神经元损伤的作用机制分子诊断与治疗杂志，（）：，（）：陈彦霖，陈诚，李泽平，等 信号通路与精神疾病关联的研究进展中国现代医学杂志，（）：丛启杰，曾荣森，刘耘溪，等大脑前额皮质基因敲低对小鼠精神分裂症样行为形成的影响江苏大学学报（医学版），（）：，（）：，：（收稿日期：修回日期：），