一种简单有效的植物RNA提取方法_张容.pdf

遗传 HEREDITAS(Beijing)28(5):583 586,2006技术与方法收稿日期:20051106;修回日期:20060118基金项目:国家自然科学基金(编号:30270090)和四川大学科研启动基金资助项目 This Work was Supported by Grant from the N ational N aturalScience Foundation of China(N o.30270090)and Fund for Promoting Scientific Research from Sichuan University作者简介:张容(1977),女,重庆人,硕士研究生,专业方向:植物分子生物学。Tel:028-85417281;E-mail:通讯作者:王胜华(1957),男,湖南人,副教授,博士,研究方向:植物分子生物学。Tel:028-88082856;E-mail:致谢:感谢四川大学生命科学学院罗通先生、张颖女士在实验过程中给予的支持和帮助。一种简单有效的植物 RNA提取方法张 容,郑彦峰,吴 瑶,王胜华,陈 放(四川大学生命科学学院,成都 610064)摘要:在提取缓冲液中加入皂土有效地去除了蛋白质并抑制 RNAse,建立了一种高效的植物 RNA 提取方法。以麻疯树幼叶为材料,分别用 TRIZOL,异硫氰酸胍法,SDS-KAc法和新创皂土法提取总 RNA 进行比较和验证,琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱分析结果表明,只有皂土法能提出质量高,完整性好的 RNA。进一步以皂土法提取的 18SrRNA 为模板的 RT-PCR结果分析表明,用该法提取的 RNA 能用于分子克隆与基因表达分析等后继分子生物学实验。该方法简便,快速,不失为一种经济高效的 RNA 提取方法。关键词:皂土;RNA 提取;麻疯树中图分类号:Q781文献标识码:A文章编号:0253-9772(2006)05-0583-04A Simple and Efficient Method for Preparation of Plant RNAsZHANGRong,ZHENGYan-Feng,WU Yao,WANGSheng-Hua,CHEN Fang(College of Life Science,Sichuan University,Chengdu 610064,China)Abstract:A new and efficient method for isolation of plant RNAs was developed by adding bentonite into extractionbuffer in order to get rid of protein and restrain RNAse.The electrophoretic patterns of nucleic acids and absorbance at230 nm,260 nm and 280 nm in a UV-Vis spectrophotometer revealed the extraction with this method can obtain RNAswith good integrity and purity without any apparent DNA contamination from the plant materials rich in with polysaccha-ride and polyphenol like Jatropha curcas leaves,to which TRIZOL reagent,SDS-KAc solution and Guanidine isothiocy-anate solution failed.Furthermore,the result of nuclear gene(18S rRNA gene)amplified by RT-PCR indicated that theRNAs prepared with this method can meet the needs of most molecular biological experiments including gene cloningand expression analysis.Key words:bentonite;RNA isolation;Jatropha curcas要了解生物某个器官或结构的功能和作用机理,一个重要的方式就是从分子角度去研究其功能基因的表达和调控,而分离得到高质量的 RNA 是进一步研究进行的首要条件。目前关于 RNA 的提取方法有很多,常用的有 TRIZOL 试剂快速提取法、苯酚法、异硫氰酸胍法 1、CsCl 梯度离心法 2、CTAB法 3,LiCl 1,4法、SDS-KAc 法 5等。不管是那种方法,Rnase 和蛋白质污染都是 RNA提取过程中造成RNA提取质量下降的主要原因。在大多数 RNA 提取方法中都是通过利用酚/氯仿进行抽提去除样品中的蛋白质,虽然行之有效,但是 RNA的损耗较大。本文在提取缓冲液中加入了皂土(bentonite),减少了后期酚/氯仿抽提的次数,从而降低了 RNA 的损耗,缩短了实验时间,并且还能有效的抑制 Rnase。DOI:牨 牥 牨 牰 牪 牳 牳 牤 j yczz 牪 牥 牥 牰 牥 牭 牥 牨 牭该方法经过实验验证对 RNA的提取极为有效,已获得成功,且操作简单,耗时少,效率高。1材料和方法1.1植物材料实验室栽培的麻疯树(Jatropha curcas)幼叶。1.2主要试剂EDTA和 DEPC 为 Amresco 公司产品;琼脂糖为 Sigma 公司产品;其余均为国产分析纯试剂。RNA提取液为:25 mmol/L 柠檬酸钠(pH 7.0),10 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,0.5%SDS,1%2-巯基乙醇,0.5%皂土。以上试剂均用 0.1%的 DEPC 室温处理过夜,然后再高压灭菌;玻璃器皿于 200 干热灭菌 8h。塑料制品用氯仿处理 5 min,再高压灭菌。水饱和酚(pH 4.7),5 mol/L KAc(pH4.8),乙二醇丁醚,氯仿/异戊醇(24 1)。1.3提取方法1.3.1 皂土法取植物绿色叶片 0.5 1.0 g,在液氮中研磨成粉末并快速转移到事先预冷的离心管中;加入 2 3mL 提取缓冲液,剧烈振荡混匀;加一倍提取缓冲液体积的水饱和酚,继续振荡混匀;再加一倍提取缓冲液体积的氯仿,振荡混匀。4,10 000 g 离心 15min。取上清液到一新管,加入 1/2 体积的 5 mol/LKAc(pH 4.8),冰上放置 10 min;4,13 000 g 离心10 min。取液相到另一新离心管,加入 1/2 体积的水饱和酚和 1/2 体积的氯仿,振荡混匀,4,10 000g 离心 5 min。重复抽提,直到界面清亮。取上清液再加入等体积的氯仿抽提一次。将上清液转到新管中,加入等体积的乙二醇丁醚,冰上放置 10 min;4,14 000 g,离心 15 min。去液相,沉淀用 75%乙醇洗 2 次。干燥,溶于适量 DEPC-H2O中,-70保存。1.3.2 TRIZOL 试剂快速提取法试剂盒购自 Invitrogen 公司,实验操作按照说明书进行。1.3.3 异硫氰酸胍法实验操作按照文献 1 方法进行。1.3.4 SDS-KAc法实验操作按照文献 5 方法进行。1.4RNA完整性及质量检测1.4.1RNA 电泳分析RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳在 1TAE中进行,琼脂糖浓度为 1%(每 100 mL 凝胶中加入 2.5 L 的 EB)。1 L 上样量,80 v 恒压 30 min,然后在紫外凝胶成像系统中观察所提取 RNA的完整性。1.4.2RNA 纯度鉴定取 1 L 样品,稀释 20 倍,紫外分光光度计测量其在 230 nm,260 nm 和 280 nm 处的紫外吸光值(A)。计算 A260/A280,A260/A230用于纯度分析。1.4.3RT-PCRRT-PCR按 TaKaRa 公司 AMV反转录酶操作手册进行。cDNA第一链合成之后,室温放置 10 min,再按常规 PCR法扩增 cDNA第二链。25 L PCR反应体系中包括 2 L cDNA,0.2 mmol dNTP,正向与反向引物各 1 mmol,15 mmol/L MgCl2,1 UTaq 酶。引物序列分别为:麻疯树 18S基因的特异引物,5 引物 P1:5 -ATTTCTGCCCTATCAACTTT-3;和 3 引物 P2:5-CCAAGGTCCA ACTACGAGC-3(根据 NC-BI 麻疯树 18S 核糖体 RNA基因序列设计;TaKaRa公司合成)。cDNA模板在 94 变性 4 min 后,扩增(94 40 s,5040 s,7290 s)35 个循环;最后72保温 10 min。以未经反转录的 PCR 和不加模板的 RT-PCR产物为对照 6。扩增结束后各取 4 L于 1%琼脂糖凝胶电泳检测。2结果2.1 皂土法中皂土浓度的确定为了寻求皂土法提取液中皂土的最适浓度,我们 分 别 在 0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%,0.7%,0.8%,0.9%,1%等 10 种不同皂土浓度的情况下提取相同质量的麻疯树幼叶 RNA,结果显示皂土浓度为 0.5%,0.6%时的效果最好,RNA条带清晰,无弥散带(图 1),因此在后续实验中采用的皂土的浓度为 0.5%。2.2 RNA完整性分析TRIZOL 法,异硫氰酸胍法及 SDS-KAc 法是实验室常用的 RNA提取方法,对于含有较多多糖与多酚的麻疯树材料,其RNA分离提取效果很差(图 2)。而用皂土法提取效果好,RNA 条带清晰,不拖尾;28S rRNA 条带的量大约是 18S rRNA 条带量的 2倍,说明 RNA几乎无降解。584遗传 HEREDITAS(Beijing)200628卷图 1不同皂土浓度提取液提取 RNA 琼脂糖凝胶电泳图M:DNA 对照;1 10:0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%和 1%的皂土提取液。Fig.1Agarose electrophoresis of total RNAsextracted by different concentration ofbentonite in extraction bufferM:DNA Marker;1 10:0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%,0.7%,0.8%,0.9%and 1%bentonite.图 24 种不同方法提取的 RNA 琼脂糖凝胶电泳图M:DNA对照;1:TR IZOL 法;2:异硫氰酸胍法;3:SDS-KAc 法;4:皂土法。Fig.2Agarose electrophoresis of totalRNAs extracted by different methodsM:DNA Marker;1:Method of TRIZOL;2:Method ofguanidine thiocyanate;3:Method of SDS-Kac;4:Bentonite method.2.3RNA纯度检测用紫外分光光度计分别测量皂土法提取 RNA的 A280,A260,A230值(表 1)。其 A260/A280比值为2.004,说明 RNA 纯度较高,几乎无蛋白质污染;A260/A230的值为 1.161,大于 1,说明皂土法提取的RNA 几乎没有多糖和酚类的污染 7。表 1皂土法提取 RNA的紫外吸收光值(A)Table 1Ratio of A260/A280and A260/A230ofRNAs extracted with bentonite method方法Method紫外吸收值(A)UVA230A260A280A260/A280A260/A230皂土法Bentonitemethod0.8170.0070.9460.0280.472 0.0282.0041.1612.4 RT-PCR以皂土法提取的 RNA 为模板,麻疯树 18SrRNA 基因特异引物 P1,P2 为引物进行 RT-PCR。预期能扩增出长度为 350 bp 左右的片段。实验结果表明,能成功的扩增出目的片段,而未反转录的和没有模板的对照没有扩增出条带。由此进一步说明皂土法提取的 RNA样品的质量好,可以进一步用于后续实验(图 3)。图 3RT-PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图M:DN A 对照;1:以皂土法提取 RNA为模板的 RT-PCR产物;2:对照 1(未反转录对照);3:对照 2(无模板对照)。Fig.3Argarose electrophoresis of RT-PCR productsM:DNA Marker;1:RT-PCRproduct(with RNA templet by bentoniteextraction);2:Control 1(without RT);3:Control 2(without templet).3讨论皂土具有吸附蛋白质及有效抑制 RNAse 的特性 8 11。利用这些特性,将皂土加入到 RNA提取缓冲液,进而设计形成了一种新的 RNA 分离提取方法。该方法在早期抑制及吸附样品中的 RNAse 等蛋白质,从而减少了后期用酚/氯仿抽提去蛋白的次数,节省了实验时间,有利于减少 RNA的降解,降低RNA的损耗。另外在沉淀之前加入 1/2 体积的 5mol/L KAc(pH 4.8),有利于去除样品中的多糖,提高样品的质量 12,13;而沉淀使用乙二醇丁醚代替传统的异丙醇和无水乙醇能有效的去除样品中的多酚类物质:50%的高浓度乙二醇丁醚可沉淀 RNA,并使多酚溶于乙二醇丁醚而被除去 14。整个实验操作简单,耗时少,一般能在 2 h 左右完成全部的操作,比起通常用的 RNA 方法需要 1 2 d 大大节约了时间。提取的 RNA样品纯度高,完整性好,可用于基因表达分析和分子克隆实验。尤其从富含多糖多酚样品材料中提取 RNA效果很好。5855期张容等:一种简单有效的植物 RNA 提取方法参 考 文 献(References):1 GUHong-Ya,QULi-Jia,MIN G Xiao-Tian.Plant Genesand Mo-lecular Manipulations.Beijing:Beijing U niversity Press,1995,74 92.顾红雅,瞿礼嘉,明小天.植物基因与分子操作.北京:北京大学出版社,1995,74 92.2 Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.MolecularCloning:Labo-ratory Manual,2nd edn.Cold Spring Harbor:Cold Spring Har-bor Laboratory Press,1989,4 5.3 Chang S J,Puryear J,Cainey J.A simple and efficient methodfor RNA isolationing from pine trees.Plant Molecular BiologyReporter,1993,11(2):113.4 ZHAO Shuang-Yi,WU Yao-R ong,XIA Guang-Min.Introductionof a simple and effective method for plant total RNA isolation.Hereditas(Beijing),2002,24(3):337 338.赵双宜,吴耀荣,夏光敏.介绍一种简单高效的植物总 RNA 提取方法.遗传,2002,24(3):337 338.5 LI Yu-Ying,WANG Zhuan-H ua,ZH ANG Zheng.An effectivemethod for extracting total R NA from Fagopyrum esculentum.Biotechnology,2004,14(3):23 24.李玉英,王转花,张政.从荞麦中提取总 RN A 的有效方法.生物技术,2004,14(3):23 24.6 LU O Yan-Yun,WEI Qin,ZHOU Li-Jun,ZHANG R ong,DENGWu-Yuan,RENChen,CH EN Fang.A simple,rapid and highlyeffective method for extracting total R NA from Jatropha curcas.Plant Physiology Communications,2005,41(3):361 364.罗言云,魏琴,周黎军,张荣,邓骛远,任琛,陈放.一种简易快速高效提取麻疯树营养器官中 R NA 的方法.植物生理学通讯,2005,41(3):361 364.7 LI Da-Li.The method of extracting total RN A from plants withplenty of secondary products.Journal of N anjing University ofScience and Technology,2001,25(5):547 549.李大力.一种从富含次生物质的植物中提取 RNA 的方法.南京理工大学学报,2001,25(5):547 549.8 ZHANG Yun-Ping,Uyemoto J K,Kirkpatrick B C.Analysis ofdouble-stranded R NAsfrom cherry trees with stem pitting inCali-fornia.Plant Disease,1998,8(8):871 874.9 Putzer H,Condon C,Brechemier-Baey D,Brito R,Grunberg-Manago M.Transfer RNA-mediated antitermination in vitro.N u-cleic Acids Research,2002,30(14):3026 3033.10Galetzka D,R usso M,Rubino2 L,Krczal G.Molecule chracter-ization of a tombusvirus associated with a disease of statice Go-niolimon tataricum(L.)Boiss.Journal of Plant Pathology,2000,82(2):151 155.11Dunn D B,Hitchborn J H.The use of bentonite in the purificationof plant viruses.Virology,1965,25:171 192.12LI Hong,WANG Xin-Li.The difficulties in the Isolation of RNAfrom plant tissues and their resolving strategies.BiotechnologyInformation,1999(1):36 39.李宏,王新力.植物组织 RNA 提取的难点及对策.生物技术通报,1999(1):36 39.13DUZhong-Jun,XUBing-Qiang,H UANG Jun-Sheng,WAN G Jia-Bao,XULi.An improved method for extracting intact total RNAfrom mango tissues rich in polysaccharides.Plant PhysiologyCommunications,2005,41(2):202 204.杜中军,徐兵强,黄俊生,王家保,徐立.一种改进的富含多糖的芒果组织中完整总 R NA 提取方法.植物生理学通讯,2005,41(2):202 204.14HE Zhen-Yan,XUWen-Zhong,YANG Xue-Xi,MA Mi.An effec-tive method of total RNA isolation from a fern Plant-PterisvittataL.Chinese Bulletin of Botany,2005,22(2):198 202.何振艳,徐文忠,杨学习,麻密.提取蕨类植物蜈蚣草总 RNA的一种有效方法.植物学通报,2005,22(2):198 202.学科发展蓝皮书 2005 卷 出版发行 遗传学报 推荐论文被收录为反映我国自然科学、技术科学和工程技术领域各学科的进展情况,由中国科学技术协会、国家自然科学基金委联合编纂,中国科学技术出版社具体组织编辑的 学科发展蓝皮书 2005 卷 于 2006 年 3 月出版发行,全书 175 万字,定价 150 元。该书共计收录综述性论文 111 篇,覆盖数学、信息科学与系统科学、力学、物理学、化学、地球学、生物学、农学、水产学等 33个科研领域。由 遗传学报 编辑部推荐的论文“体细胞核移植胚胎核重编程的研究进展”(作者:杨正田、沈 伟、邓继先,刊登在 遗传学报 2004 年第 6 期)被收录入生物学领域。该文较为系统地介绍了克隆胚胎过程中遇到的核重编程问题的一些研究进展。除此文以外,生物学学科领域还收录有其他研究方向的 10 篇文章。遗传学报 编辑部586遗传 HEREDITAS(Beijing)200628卷