茎尖离体培养小黄姜变异株品质特征及转录组学分析.pdf

收稿日期:2 0 2 2-1 2-1 7基金项目:贵州省农科院青年基金(黔农科院青年基金2 0 2 01 8号);贵州省科技支撑计划项目(黔科合支撑2 0 2 1 一般2 6 0);贵州省农业科学院种质资源项目(黔农科种质资源2 0 2 31 6号)。作者简介:侯颖辉(1 9 8 8),女(汉族),山东人;硕士,助理研究员,研究方向:辛香料成分分析及产品开发(E-m a i l:h o u y i n g h u i-o k 1 6 3.c o m)。通讯作者:李德文(1 9 7 9),男(汉族),贵州人;硕士,副研究员,研究方向:作物遗传育种(E-m a i l:1 6 3 5 6 4 8 6q q.c o m)。茎尖离体培养小黄姜变异株品质特征及转录组学分析侯颖辉1,2,王少铭1,2,罗莉斯1,2,李晋华1,2,冷家归1,2,汪志燚1,2,李德文1,2(1.贵州省农业科学院香料研究所,贵阳5 5 0 0 0 6;2.贵州省农业科学院油料研究所,贵阳5 5 0 0 0 6)摘 要:本研究采用恒温干燥法、水蒸气法和HP L C等方法分析茎尖离体培养小黄姜变异株的干物质含量、精油含量、姜辣素含量等品质特性,并利用高通量测序技术和生物信息学方法进行转录组学分析。结果表明,小黄姜突变株干物质、纤维素含量显著低于正常株,分别为1 3%和0.6%;木质素、精油及姜辣素含量分别为正常株的1.5倍、1.5 4倍和1.2 6倍。转录组学分析共获得4 39 8 9条U n i g e n e的注释结果,1 33 4 2个S S R标记。获得D E G3 3 8条,其中,上调表达1 6 4条,下调表达1 7 4条。有信息注释D E G的2 3 9条,分别在G O、C OG、K E G G、KOG、P f a m、S w i s s-P r o t、e g g NOG等功能数据库注释到D E G1 3 2条、8 8条、8 1条、1 3 0条、1 8 6条、1 7 1条 和2 2 4条。D E G s主要集中在光合作用碳的固定(G OT 1)、植物激素信号传导(AXU/I A A、B-A R R、E R F L 1/2、MY C 2)、萜烯类和姜辣素等次生代谢物的合成(CH S)、植物生理节律(C R Y)等生物途径。由此可知,AXU/I A A、B-A R R、E R F L 1/2、MY C 2等基因的差异表达导致小黄姜突变株的精油含量、姜辣素含量以及其他农艺性状发生改变,故在栽培前期可以通过对相关基因的表达差异分析确定植株属性,从而区分正常株与突变株。关键词:茎尖离体培养;小黄姜;突变;品质;转录组学D O I:1 0.1 6 5 9 0/j.c n k i.1 0 0 1-4 7 0 5.2 0 2 3.0 6.0 3 4中图分类号:S6 3 2.5 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 1-4 7 0 5(2 0 2 3)0 6-0 0 3 4-0 8Q u a l i t yC h a r a c t e r i s t i c sa n dT r a n s c r i p t o m i cA n a l y s i so fD i o s c o r e az i n g i b e r e n s i sM u t a n t sP r o d u c e df r o mS h o o tT i p sC u l t u r e d i nV i t r oH O UY i n g h u i1,2,WA N GS h a o m i n g1,2,L U OL i s i1,2,L IJ i n h u a1,2,L E N GJ i a g u i1,2,WA N GZ h i y i1,2,L ID e w e n1,2(1.G u i z h o uI n s t i t u t eo fS p i c eC r o p s,G u i z h o uA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,G u i y a n g5 5 0 0 0 6,C h i n a;2.G u i z h o uI n s t i t u t eo fO i lC r o p s,G u i z h o uA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,G u i y a n g5 5 0 0 0 6,C h i n a)A b s t r a c t:T h ed r ym a t t e r c o n t e n t,e s s e n t i a l o i l c o n t e n t,g i n g e r o l c o n t e n t a n do t h e r q u a l i t yc h a r a c t e r i s-t i c sw e r ea n a l y z e db yc o n s t a n t t e m p e r a t u r ed r y i n gm e t h o d,s t e a m m e t h o da n dH P L C.H i g ht h r o u g h-p u ts e q u e n c i n gt e c h n o l o g ya n db i o i n f o r m a t i c sm e t h o d sw e r eu s e df o rt r a n s c r i p t o m i ca n a l y s i s.T h er e s u l t ss h o w e d t h a t t h e c o n t e n t o f d r ym a t t e r a n dc e l l u l o s e i n t h em u t a n tw e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a nt h a t i nt h en o r m a l s,w h i c hw e r e1 3%a n d0.6%,r e s p e c t i v e l y.T h ec o n t e n t so f l i g n i n,e s s e n t i a lo i la n dg i n g e r o lw e r e1.5t i m e s,1.5 4t i m e sa n d1.2 6t i m e so f t h a to fn o r m a lp l a n t,r e s p e c t i v e l y.At o t a lo f 4 39 8 9U n i g e n ea n n o t a t i o nr e s u l t sa n d1 33 4 2S S Rm a r k e r sw e r eo b t a i n e db yt r a n s c r i p t o m i ca n a l y-s i s.3 3 8D E G sw e r eo b t a i n e d,o fw h i c h1 6 4 w e r eu p-r e g u l a t e da n d1 7 4 w e r ed o w n-r e g u l a t e d.2 3 9D E G s,a n n o t a t e d1 3 2,8 8,8 1,1 3 0,1 8 6,1 7 1a n d2 2 4D E G si nGO,C OG,K E G G,P f a m,S w i s s-P r o t,e g g NOGa n do t h e r f u n c t i o n a ld a t a b a s e s,r e s p e c t i v e l y.D E G sm a i n l yf o c u s e do np h o t o s y n t h e t i cc a r b o nf i x a t i o n(GOT 1),p l a n th o r m o n es i g n a l i n g(AXU/I A A,B-A R R,E R F L 1/2,MY C 2),s y n t h e s i so f t e r p e n e s,g i n g e r o l a n do t h e rs e c o n d a r ym e t a b o l i t e s(CH S),a n dp l a n t c i r c a d i a nr h y t h m43侯颖辉 等:茎尖离体培养小黄姜变异株品质特征及转录组学分析 种 子 第4 2卷 第6期表1 C l e a nD a t a与组装的U n i g e n e库的比对结果T a b l e1 C o m p a r i s o nr e s u l t so fC l e a nD a t a n da s s e m b l yU n i g e n e材料BMK-I DC l e a nR e a d s/b p映射比量/b p映射比率/%C K 12 69 9 64 0 81 70 6 61 5 46 3.2 2正常株C K 22 60 9 35 0 91 68 4 23 9 36 4.5 5C K 32 26 9 95 7 51 28 7 95 2 85 6.7 4t r e a t 12 01 4 14 7 91 19 9 26 4 25 9.5 4突变株t r e a t 22 78 1 22 4 11 70 3 01 9 36 1.2 3t r e a t 33 16 7 07 1 02 04 3 24 6 16 4.5 2(C R Y)a n do t h e rb i o l o g i c a lp a t h w a y s.T h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fA X U/I A A,B-A R R,E R F L 1/2,M Y C 2a n do t h e rg e n e s l e d t oc h a n g e s i ne s s e n t i a l o i l c o n t e n t,g i n g e r o l c o n t e n t a n do t h e r a g r o n o m i c t r a i t so ft h em u t a n t.T h e r e f o r e,p l a n t a t t r i b u t e s c o u l db e d e t e r m i n e db yd i f f e r e n t i a l a n a l y s i s o f r e l a t e dg e n e s e x p r e s s i o ni n t h e e a r l ys t a g eo f c u l t i v a t i o n,s oa s t od i s t i n g u i s hn o r m a l a n dm u t a n t p l a n t s.K e yw o r d s:s h o o t t i p sc u l t u r e d i nv i t r o;D i o s c o r e az i n g i b e r e n s i s;m u t a t i o n;q u a l i t y;t r a n s c r i p t o m e 小黄姜(D i o s c o r e az i n g i b e r e n s i s)是生姜的一种,因其根状茎较小,颜色金黄而得名,与普通生姜相比,其姜辣素、姜黄素等活性成分含量更高,更具药食及研究价值1。贞丰小黄姜、水城小黄姜已成为地理标志性产品。由于小黄姜为无性繁殖,播种需要消耗大量姜块,加上生姜连作障碍严重,易发姜瘟病,小黄姜的产量相对较低,为了提高产量和减少成本,小黄姜茎尖离体培养技术被广泛研究2。据报道,茎尖离体培养技术能够有效降低植株体内病毒数量,降低病毒病的发生率3-4。通过小黄姜茎尖离体培养获得的小黄姜组培苗栽培后产生了一定频率的表型突变,突变率为1 0%左右,突变株植株矮小、分枝数多、产量较低。本研究主要从品质表现及转录组学两个方面分析突变株与正常株的主要差异,揭示突变产生的机制,以期在育苗期筛选出突变株,从而减少后续实验投入和栽培成本。同时,对小黄姜种质资源创新具有重要理论意义。1 材料与方法1.1 材 料以贵州地理标志性产品镇宁小黄姜为母本,通过茎尖离体培养技术得到小黄姜突变株和正常株原种,按照每小区3 0株定植,株距1 5 c m,行距3 0 c m。使用采收后的鲜姜进行品质检测,在根状茎膨大期后期选择健康且长势一致的脱毒正常株和突变株根状茎,在北京百迈客生物科技有限公司进行转录组分析。1.2 方 法1.2.1 品质检测采用恒温干燥法5检测样品中干物质含量,水蒸气及G C-M S技术6分析样品中精油含量,试剂盒法检测纤维素和木质素含量,有机溶剂萃取法和H P L C技术7分析姜辣素(以6-姜酚计)含量。1.2.2 转录组学测序T r i z o l法提取样品R NA,利用边合成边测序技术与I l l u m i n aH i s e q高通量测序平台8和分析c D NA文库,获得的高质量R e a d s再 利 用 生 物 信 息 学 分 析,通 过 与N R、K E G G、S w i s s-P r o t、C OG、GO和P f a m数据库9的比对U n i g e n e进行功能注释。2 结果与分析2.1 品质分析通过品质检测(图1)发现,小黄姜突变株干物质、纤维素含量显著低于正常株,分别为1 3%和0.6%,而木质素、精油及姜辣素含量则显著高于正常株,分别为0.6 3%、0.0 4 3m L/g和8.5m g/g,分别为正常株的1.5倍、1.5 4倍和1.2 6倍。2.2 转录组学分析各样品Q 3 0碱基百分比均在9 3.7 9%及以上,C l e a nD a t a均达到6.0 1G b,6个样品共获得4 6.3 3G bC l e a nD a t a。组装后共获得U n i g e n e1 0 02 8 0条,长度在1k b以上的有3 06 8 7条。2.2.1 测序数据产出统计如表1所示,不同样品的C l e a nD a t a与组装的U n i g e n e库 进 行 比 对 得 知 突 变 株 映 射 比 率 为5 9.5 4%6 4.5 2%;正常株的映射比率为5 6.7 4%6 4.5 5%。2.2.2 U n i g e n e功能注释及表达量分析使用B L A S T1 0软件(E-v a l u e1 e-5)将获得的U n i g e n e序列分别与GO1 3、C OG1 4、KOG1 5、e g g-NOG 4.51 6等 多 个 数 据 库 进 行 比 对 分 析,并 使 用KO B A S 2.01 7分析U n i g e n e序列在K E G G中的功能注释,氨基酸序列预测之后再通过HMME R1 8软件(E-v a l u e 1 e-1 0)在P f a m1 9数据库分析比对9,从而获得不同序列的注释信息。最终获得有注释信息的U n i g e n e4 39 8 9个(表2)。53种子,2 0 2 3,4 2(6):3 4-4 1.h t t p:/z h z i.g z n y z y x y.c n S e e d V o l.4 2 N o.0 6 J u n.2 0 2 3图1 小黄姜突变株与正常株品质比较F i g.1 C o m p a r i s o no fq u a l i t yb e t w e e nm u t a n t a n dn o r m a l g i n g e ro fD i o s c o r e az i n g i b e r e n s i s表2 U n i g e n e注释统计T a b l e2 U n i g e n ea n n o t a t i o ns t a t i s t i c s功能数据库 注释数量3 0 0长度10 0 0长度10 0 0C O G_A n n o t a t i o n1 22 5 724 5 186 2 0GO_A n n o t a t i o n2 49 1 679 0 01 35 7 2K E G G_A n n o t a t i o n1 70 5 754 5 892 9 1KOG_A n n o t a t i o n2 35 6 868 1 31 37 8 2P f a m_A n n o t a t i o n2 78 3 270 4 91 84 6 8S w i s s p r o t_A n n o t a t i o n3 02 5 393 5 31 75 1 1e g g NO G_A n n o t a t i o n4 06 0 61 32 3 82 23 7 0n r_A n n o t a t i o n4 32 8 81 45 8 12 30 8 2A l l_A n n o t a t e d4 39 8 91 48 8 92 31 6 5 将 测 序 得 到 的R e a d s与U n i g e n e库通过B o w t i e2 0软 件进行比对,并结合R S EM2 1估计其表达量水平。U n i g e n e的表达丰度2 2利用F P KM值2 3(F r a g-m e n t sP e rK i l o b a s eo f t r a n s c r i p tp e rM i l l i o nm a p p e dr e a d s)表示。由图2可知,蛋白质编码基因表达水 平F P KM值 横 跨1 0-2到1 04六 个 数 量 级。另 外,从 图3中可以得知单个样品基因表达水平分布的离散程度和整体基因表达丰度。2.2.3 S S R及S N P分析 利用M I S A(M I c r o S A t e l l i t ei d e n t i f i c a t i o nt o o l)软件对1k b以上的U n i g e n e序列进行分析,鉴定出6种类型的S S R2 4(表3),合计1 33 4 2个,并对不同类型的S S R进行密度分布统计(图3)。利用软件S T A R2 5和GAT K2 6针对R NA-S e q识别 单 核 苷 酸 多 态 性(S i n g l e N u c l e o t i d eP o l y m o r-p h i s m,S N P)位点。根据S N P位点的等位(A l l e l e)数目将S N P位点分为纯合型S N P位点(H o m o S N P,只有一个等位)和杂合型S N P位点(H e t e S N P,两个或多个等位)。各样品S N P位点 数目统计见 表4,并对S N P在U n i g e n e上的分布密度进行统计(图4)。表3 S S R分析结果统计T a b l e3 S t a t i s t i c a l t a b l eo fS S Ra n a l y s i sr e s u l t s类型数量/个c5 6 6c*1 5p 180 9 4p 218 7 5类型数量/个p 325 9 6p 41 5 1p 52 7p 61 8 注:c为复合型重复S S R;c*为位置有重叠的复合类型S S R;p 1为单碱基重复S S R;p 2为双碱基重复S S R;p 3为三碱基重复S S R;p 4为四碱基重复S S R;p 5为五碱基重复S S R;p 6为六碱基重复S S R。下同。63侯颖辉 等:茎尖离体培养小黄姜变异株品质特征及转录组学分析 种 子 第4 2卷 第6期 注:a为F P KMd e n s i t yd i s t r i b u t i o n;b为F P KMb o xd i a g r a m。图2 各样品的密度分布对比以及F P KM箱线图 F i g.2 C o m p a r i s o no fd e n s i t yd i s t r i b u t i o na m o n gd i f f e r e n t s a m p l e sa n dF P KMb o xd i a g r a ma n dF P KMb o xd i a g r a m表4 S N P数量统计T a b l e4 S N Pn u m b e r s t a t i s t i c s材料样品编号纯合型杂合型合计C K 11 1 13 6 82 3 01 2 13 4 14 8 9正常株C K 21 0 49 0 32 5 63 9 33 6 12 9 6C K 31 0 83 0 81 9 70 7 03 0 53 7 8t r e a t 11 1 10 4 41 8 95 8 63 0 06 3 0突变株t r e a t 21 1 24 0 52 2 64 2 13 3 88 2 6t r e a t 31 0 43 6 12 5 16 8 43 5 60 4 5图3 S S R密度分布F i g.3 S S Rd e n s i t yp r o f i l e2.2.4 D E G分析采用D E S e q 22 7软件结合F D R(F a l s eD i s c o v e r yR a t e)与F C(F o l dC h a n g e)对样品进行组间差异表达分析,共得到D E G(D i f f e r e n t i a l l yE x p r e s s e dG e n e s)3 3 8条,其中1 6 4条基因表达量上调,1 7 4条基因表达量下调(图5)。一个点代表一个基因,横坐标为基因在两样品中表达量差异倍数的对数值,两样品间的表达量倍数差异越大,对应的绝对值越大。并对筛选出的D E G做层次聚类分析(图6)。通过与不同功能数据库比对,获得注释D E G2 3 9条,分别在C OG、GO、K E G G等数据库9注释到8 8条、1 3 2条、8 1条、1 3 0条、1 8 6条、1 7 1条、2 2 4条、2 3 8条(表5)。图4 S N P密度分布F i g.4 S N Pd e n s i t yp r o f i l e 注:绿色为下调D E G,红色为上调D E G,黑色为无显著性表达差异基因。图5 差异表达基因MA图F i g.5 MA m a po fD E G s73种子,2 0 2 3,4 2(6):3 4-4 1.h t t p:/z h z i.g z n y z y x y.c n S e e d V o l.4 2 N o.0 6 J u n.2 0 2 3表5 注释的差异表达基因数量统计T a b l e5 A n n o t a t e ds t a t i s t i c a l o nt h en u m b e ro fd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sD E GS e tA n n o t a t e dC O GGOK E G GKO GP f a mS w i s s-P r o te g g NO GC K 1_C K 2_C K 3_v s_t r e a t 1_t r e a t 2_t r e a t 32 3 98 81 3 28 11 3 01 8 61 7 12 2 4表6 主要D E G功能分析T a b l e6 M a i nD E Gf u n c t i o na n a l y s i s基因名称K E G G途径功能 上调/下调效果 G O T 1光合作用碳的固定促进草酰乙酸转化为天冬氨酸上调增加天冬氨酸的合成减少了苹果酸的形成AXU/I A A植物激素信号传导调控生长素信号传导上调反向调控生长素应答因子A R FB-A R R植物激素信号传导细胞分裂素应答因子下调促进细胞分裂E R F L 1/2植物激素信号传导乙烯信号传导上调促进果实成熟衰老MY C 2植物激素信号传导茉莉酸信号途径调控因子上调植物逆境相关CHS类黄酮生物合成促进类黄酮合成上调促进p-香豆素-C o A合成C R Y植物生理节律光敏受体(蓝光受体)下调调节植物节律性图6 差异表达基因表达模式聚类F i g.6 C l u s t e r i n gm a po fd i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o ng e n ee x p r e s s i o np a t t e r n s图7 D E G的KOG富集分析F i g.7 KOGe n r i c h m e n t a n a l y s i so fD E G图8 D E G的e g g NOG富集分析F i g.8 e g g NOGe n r i c h m e n t a n a l y s i so fD E G 通过不同功能数据库的富集分析发现,D E G主要集中于次生代谢合成、信号传导机制、类黄酮代谢、光 合作用碳的固定等过程。主要D E G的功能分析见83侯颖辉 等:茎尖离体培养小黄姜变异株品质特征及转录组学分析 种 子 第4 2卷 第6期 图9 D E G的G O二级节点注释统计 F i g.9 A n n o t a t e ds t a t i s t i c a lm a po fG Os e c o n d a r yn o d e so fD E G s图1 0 D E G的K E G G分类F i g.1 0 K E G Gc l a s s i f i c a t i o no fD E G s表6,其中植物激素信号传导相关基因4个(AXU/I A A、B-A R R、E R F L 1/2、MY C 2),光合作用相关基因1个(G O T 1),植物生理节律相关基因2个(C R Y、CHS),类黄酮生物合成相关基因1个(CHS)。除B-A R R、C R Y为下调外,其余基因均上调。93种子,2 0 2 3,4 2(6):3 4-4 1.h t t p:/z h z i.g z n y z y x y.c n S e e d V o l.4 2 N o.0 6 J u n.2 0 2 3 图1 1 D E G的K E G G通路富集散点图 F i g.1 1 E n r i c h m e n t s c a t t e rp l o to fK E G Gp a t h w a yo fD E G s3 结论与讨论转录学分析是在mR NA水平上研究表型差异的有效方法,转录组测序技术能够准确获得不同组织,不同时期相关基因的表达水平。孔德真等2 8利用转录组学分析鉴定出盐胁迫、碱胁迫相关的D E G9 0 0多个,陈浩等2 9基于转录组测序获得S S R引物1 03 2 0对,郑世茂等3 0基于转录组测序获得S S R引物3 7 1 7 3对,成功率为7 0.3 9%。杨博涵等3 1利用转录组测序技术分析了阳春砂花丝、花柱,得到6 2 1 7 4条U n i g e n e注释,涉及2 5个功能分类。本研究中,小黄姜突变株与正常株来源于同一植株的茎尖组织,通过组织培养后产生不同的表型,经检测发现,其品质与正常株和母体均具有显著差异。通过转录组分析发现,注释到的差异表达基因2 3 9条,分别在C OG、GO、K E G G、KOG、P f a m、S w i s s-P r o t、e g g-NOG功能数据库注 释到8 8条、1 3 2条、8 1条、1 3 0条、1 8 6条、1 7 1条和2 2 4条,主要涉及光合作用碳的固定、次生代谢物合成、植物信号传导等2 0余个功能分类。其中,光合作用碳的固定与干物质含量、纤维素和木质素含量关系密切3 2,根据光合作用K E G G途径推测可能G O T 1基因的高表达会促进草酰乙酸转化为天冬氨酸,减少了苹果酸的形成,从而降低碳水化合物的积累。生姜精油、姜辣素等次生代谢物含量差异主要由于次生 代谢物合成 相关基因的 差异表达导致3 3。植物激素信号传导调控植物的整个生命过程,包括细胞分裂和分化,是植株分枝/分蘖的主要内在因素3 4,该通路相关基因的差异表达导致了突变株与正常株之间分枝数与产量的差异,尤其AXU/I A A,作为生长素应答因子A R F的抑制因子3 5,其高表达抑制了植株根状茎的生长,从而导致产量下降。获得D E G以及S N P序列有助于在栽培前期筛选出突变株,以减少栽培的时间和物质成本。另外,由于小黄姜为无性繁殖作物,种质创新较难,该突变株的产生对于小黄姜综合利用和种质资源创新具有重要理论意义。参考文献:1 宋丽丽,李科娜,杨旭,等.小黄姜精油提取工艺优化、成分分析及其生物活性研究J.轻工学报,2 0 2 0,3 5(5):7-1 5.2 黄科,刘奕清,陈泽雄,等.茎尖脱毒生姜组培苗病原检测研究J.北方园艺,2 0 1 1(8):1 4 8-1 5 0.3 李帼英,杨俊霞,周代琴.试管苗热处理结合茎尖培养脱除苹果矮化自根砧M 9-T 3 3 7、B 9、GM 2 5 6、M 2 6病毒试验J.果树资源学报,2 0 2 3,4(2):1 2-1 4.4 曹立娜,刘洋,张恭,等.紫甘薯茎尖分生组织诱导培养基的优化研究J.现代农村科技,2 0 2 2(1 2):7 2.5 马义虎,何贤彪,陈剑,等.秧龄对浙东南地区优质稻产量和品质的影响J.作物杂志,2 0 2 3(3):1 1 6-1 2 5.6 鹿浩志,刘敏轩,田亚亚,等.生姜精油的提取及G C-M S分析J.食品工业科技,2 0 1 9,4 0(1 4):2 0 8-2 1 3,2 2 6.7 崔秋兵,张楠,由耀辉,等.泡姜中5种姜辣素的HP L C含量测定J.食品与发酵科技,2 0 2 2,5 8(4):1 4 4-1 4 7.8 向杰.盐胁迫条件下非洲哈茨木霉胞外聚合物的组成及功能研究D.北京:中国农业科学院,2 0 1 9.9 姚运法,练冬梅,林碧珍,等.硒处理下冰菜的转录组响应及相关基因功能分析J.西南农业学报,2 0 2 1,3 4(1 2):2 7 3 7-2 7 4 7.1 0A l t s c h u lS F,M a d d e n T L,S c h f f e r AA,e ta l.G a p p e dB L A S Ta n dP S IB L A S T:A N e w G e n e r a t i o no fP r o t e i nD a t a b a s eS e a r c hP r o g r a m sJ.N u c l e i cA c i d sR e s e a r c h,1 9 9 7,2 5(1 7):3 3 8 9-3 4 0 2.1 1D e n gY Y,L iJ Q,W uS F,e ta l.I n t e g r a t e dn rD a t a b a s ei nP r o t e i nA n n o t a t i o nS y s t e ma n dI t sL o c a l i z a t i o nJ.C o m-04侯颖辉 等:茎尖离体培养小黄姜变异株品质特征及转录组学分析 种 子 第4 2卷 第6期p u t e rE n g i n e e r i n g,2 0 0 6,3 2(5):7 1-7 2.1 2A p w e i l e rR,B a i r o c hA,WuCH,e ta l.U n i P r o t:t h eu n i v e r-s a lp r o t e i n k n o w l e d g e b a s eJ.N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h,2 0 0 4,3 2:D 1 1 5-9.1 3A s h b u r n e rM,B a l lC A,B l a k eJA,e ta l.G e n eo n t o l o g y:t o o lf o rt h eu n i f i c a t i o no fb i o l o g yJ.N a t u r eg e n e t i c s,2 0 0 0,2 5(1):2 5-2 9.1 4T a t u s o vRL,G a l p e r i n M Y,N a t a l eD A.T h eC OGd a t a-b a s e:at o o l f o rg e n o m es c a l ea n a l y s i so fp r o t e i nf u n c t i o n sa n de v o l u t i o nJ.N u c l e i cA c i d sR e s e a r c h,2 0 0 0,2 8(1):3 3-3 6.1 5K o o n i nEV,F e d o r o v aN D,J a c k s o nJD,e ta l.Ac o m p r e-h e n s i v ee v o l u t i o n a r yc l a s s i f i c a t i o no fp r o t e i n se n c o d e di nc o m p l e t ee u k a r y o t i cg e n o m e sJ.G e n o m eB i o l o g y,2 0 0 4,5(2):R 7.1 6J a i m eH C,D a m i a nS,K r i s t o f f e rF,e ta l.e g g NOG4.5:ah i e r a r c h i c a l o r t h o l o g y f r a m e w o r kw i t h i m p r o v e d f u n c t i o n a la n n o t a t i o n s f o re u k a r y o t i c,p r o k a r y o t i ca n dv i r a l s e q u e n c e sJ.N u c l e i cA c i d sR e s e a r c h,2 0 1 6,4 4:2 8 6-2 9 3.1 7C h e nX,X i z e n gM,J i a j uH,e t a l.KO B A S2.0:aw e bs e r v e rf o ra n n o t a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fe n r i c h e dp a t h w a y sa n dd i s e a s e sJ.N u c l e i cA c i d sR e s,2 0 1 1,3 9:3 1 6-3 2 2.1 9E d d yS.R.P r o f i l eh i d d e n M a r k o vm o d e l sJ.B i o i n f o r m a t-i c s,1 9 9 8,1 4(9):7 5 5-7 6 3.2 0F i n nRD,B a t e m a nA,C l e m e n t sJ,e ta l.P f a m:t h ep r o t e i nf a m i l i e