进境玉米病害分子检测技术研究进展.pdf

7676农学经济进境玉米病害分子检测技术研究进展徐平万晓泳邓艳凤王建斌郑斯竹陈云芳（苏州海关综合技术中心，江苏苏州215031）摘要：玉米作为我国进口粮食的重要种类，进口数量逐年增加。进境玉米携带的病原物形态特征复杂，常规分离纯化手段难以获得检测目标，导致日常检测工作难度大，而且检测效率低，检测速度慢。分子生物学检测技术具有快速、准确、简便、灵敏等优点，既可以满足玉米快速通关要求，又可以有效地检测出玉米携带的有害生物，因此该技术被广泛应用于玉米病害检测。该文主要综述了基于 P C R的分子生物检测方法和纳米孔测序技术在玉米病害检测中的应用现状及前景。关键词：进境玉米；病害；分子检测；纳米孔测序中图分类号：S435.13文献标识码：A文章编号：2096-0743（2023）20-0076-03玉蜀黍，俗称玉米（Z e a m a y s L.）属禾本科玉蜀黍属植物。玉米籽粒中含有大量的淀粉和蛋白质，可供人类食用，或作为饲料。此外玉米还有广泛的工业用途，可用来酿酒、制作玉米淀粉、酒精、葡萄糖等。玉米的适应性很强，在全世界广泛种植，种植区从北纬 5 8 到南纬 4 0，种植国家有1 6 0 多个。联合国粮食及农业组织2 0 2 1 年数据表明，全世界玉米年产量为 1 1.5 亿 t，种植面积为 1.9 7 亿 h m2。近年来，我国与世界各国的大宗货物贸易量逐年增加，2 0 2 1 年，我国进口粮食总量为 1 6 4 5 3.9 万 t，同比增长了1 8.1%，进口玉米总量为 2 8 3 5 万 t，同比增长了 1 5 0.9%。随着进境贸易量的增加，我们既要保障玉米可以快速通关，又要有效地检测出进境玉米携带的有害生物，保护国门生物安全。由于进境玉米携带的病原物形态特征复杂，如进口玉米种子表面包裹种衣剂，分离纯化培养困难，利用病原物常规检测方法进行检测的难度较大，并且效率低、速度慢，因此越来越多的分子生物学检测技术被应用于玉米病害的检测。本文综述了基于聚合酶链式反应（P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n,P C R）的分子生物学技术和纳米孔测序技术在进境玉米病害检测上的应用现状及前景预测。1以 PCR 为基础的检测方法1.1 常规 P C R技术P C R技术广泛应用于基因测序、病害诊断等多个领域。在植物病原真菌检测中，黄国明等 1 分析了黑麦草上的三种黑粉菌的 D N A序列差异，设计了小麦矮腥黑穗病菌的特异引物，建立了该病原菌的检测方法。在植物病原细菌的检测中，A n o n y m o u s 等根据玉米细菌性枯萎病菌的 B r p S基因建立了该病原菌的特异性检测方法。在植物病毒的检测中，张卫东等 2 根据黄瓜绿斑驳花叶病毒运动蛋白基因序列设计特异性引物，建立了黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异性检测方法。在进境玉米病害的检测中，P C R技术发挥了巨大的作用。2 0 1 1 年，刘洪义等 3 从德国邮寄进境的玉米种子中，利用 P C R和基因测序相结合的方法检测出玉米褪绿斑驳病毒。沈建国等 4 利用 D A S-E L I S A、R T-P C R和序列测定方法，从阿根廷进境的玉米种子中检测出玉米褪绿斑驳病毒（M C M V）、玉米矮花叶病毒（M D M V）。2 0 1 6 年，段维军等 5 从乌克兰进境玉米混杂的向日葵籽中检测出检疫性真菌向日葵间座壳菌（D i a p o r t h e h e l i a n t h i）。2 0 1 6 年，厦门口岸从来自英国的邮寄物中截获甜玉米、秋英、多叶羽扇豆等二十几种作物的种子，这些种子被送往实验室进行检测鉴定，其中在甜玉米种子中，检测出检疫性有害生物洋葱腐烂病菌。2 0 1 8 年，王佳莹等采用分子生物学与血清学方法，从来自乌克兰的玉米中，首次检测出小麦线条花叶病毒 6。1.2 荧光定量 P C R技术荧光定量 P C R技术是 P C R与荧光技术的结合，在P C R反应体系中加入荧光染料或荧光标记特异探针，根据标准曲线进行定量分析。荧光定量 P C R技术不仅比常规P C R技术更灵敏，还可用于定量分析。李巍等使用水稻细菌性谷枯病的 g y r B基因，设计出特异性引物，建立了水稻细菌性谷枯病的荧光检测方法。张克渝等 7 根据多堆柄锈菌的 I T S 序列设计出多堆柄锈菌 基金项目 本研究得到 2 0 2 2 年度南京海关科技计划项目“进境玉米携带病害的宏基因组研究”（项目编号：2 0 2 2 K J 1 8）资助。作者简介 徐平（1 9 8 2），男，汉族，江苏盐城人，本科，农艺师，主要从事植物病害检测工作。通讯作者 陈云芳（1 9 7 7），女，汉族，河北高碑店人，博士，高级农艺师。研究方向：植物有害生物检疫鉴定。电子邮箱：f a z y c h e n 1 6 3.c o m。7777农学经济特异性引物 P p o F/P p o R和 T a q M a n 探针 P p o P，根据玉米A c t i n 2 基因序列设计出玉米特异性引物 Z m F/Z m R和 T a q M a n 探针 Z m P，利用引物和探针，建立了多堆柄锈菌在潜育期的实时荧光定量 P C R检测体系。李天聪等 8 利用实时荧光定量 P C R（q R T-P C R）技术研究出玉米大斑病菌在侵染寄主过程中的表达模式。魏国荣等建立了基于-a c t i n基因的玉米黑粉菌实时荧光定量 P C R检测体系，以引入的p M D 1 9 T-S i m p l e 质粒为标准，采用浓度梯度，实现了玉米黑粉菌的快速定量检测。1.3 多重 P C R技术多重 P C R是在同一个反应体系中，利用两对以上的特异性引物，同时对多个目的基因进行扩增，利用多重 P C R可以在一个反应体系同时检测多个病原物，降低了检测成本，缩短了检测时间。多重P C R技术可以同步检测多种病原微生物，成本低，效率高，在植物检疫中应用比较广泛。周灼标等利用多重P C R方法对李痘病毒（P P V）、李属坏死环斑病毒（P N R S V）进行了定性检测研究。代玉立等 9 设计出玉米大斑病菌、小斑病菌交配型多重 P C R检测特异性引物，建立了两种病菌交配型的多重 P C R检测方法。吴晓巍设计筛选了针对玉米细菌性枯萎病、玉米内州萎蔫病、苜蓿细菌性萎蔫病菌、番茄溃疡病菌的特异性引物及探针，建立了这四种病原菌的多重P C R扩增方法，有效扩增了各菌株的目的基因片段。2 0 1 4 年，叶露飞等 1 0 利用巢式 P C R从进境玉米中检测出玉米内州萎蔫病菌，检出率为普通 P C R的 3 倍。1.4 环介导等温扩增技术2 0 0 0 年，环介导等温扩增（L A M P）技术是日本学者N o t o m i 以传统 P C R技术为基础，发展起来的一种新的体外核酸扩增方法。L A M P 技术目前广泛用于检测真菌、细菌、病毒等病原物，是体外等温扩增检测病原物的主要方法之一。We i 等利用L A M P 技术设计了“一步法”，检测菜豆荚斑驳病毒（B e a n p o d m o t t l e v i r u s,B P M V）。M a t h i a s 等 1 1 利用L A M P 技术检测玉米条纹病毒（M a i z e s t r e a k v i r u s,M S V），具有高度特异性和可重复性。封立平等 1 2 利用 L A M P 快速检测玉米细菌性枯萎病菌，可以有效区分玉米细菌性枯萎病菌的近缘种。单长林等 1 3 根据玉米内州萎蔫病菌1 6 S-2 3 S 序列，设计环介导等温扩增引物，反应时间缩短到 3 0 m i n，建立了玉米内州萎蔫病菌 L A M P 检测体系，大大提高了检测的效率。1.5 D N A条形码技术2 0 0 3 年，加拿大 P a u l D.N.H e b e r t 教授从零售业条形码技术中得到了启示，利用线粒体细胞色素 C氧化酶亚基 I基因（C O I）中的一段短序列，实现了对一些动物类群的物种鉴定，实现了物种名称与实体的实时匹配，即 D N A条形码技术（D N A B a r c o d i n g）。C O I 基因在动物领域得到广泛认可，由于真菌中的 C O I 基因序列包含多个内含子，C O I 基因在开展微生物条形码研究中存在很大困难。第四届国际生命条形码大会，I T S 被推荐为真菌 D N A条形码上的基础序列。D N A条形码技术（D N A B a r c o d i n g）可以利用标准的、易扩增且相对较短的D N A片段，对物种进行无目标检测，加快对新物种的鉴定。真菌D N A 条形码技术与动植物相比，研究进展较慢，I T S 序列是它的基本序列，但不是所有真菌都适用。为进一步开展真菌 D N A条形码研究，C a l m i n G等利用 D N A条形码和直接 P C R的原理，成功区分腐霉属真菌和疫霉属真菌。王琳 1 4 根据 2 3 种 5 0 个镰孢菌株的1 5 0 条序列，利用 D N A条形码进行筛选，找出了最适用于作为镰孢菌的 D N A条形码。史芳芳等 1 5 从已分离自不同寄主获得的两种 1 9 个丝核菌菌株作为材料，对测序获得的有效基因序列进行研究，筛选出丝核菌属D N A条形码。利用 D N A条形码技术筛选出一个较短的标准 D N A序列鉴定出某一个属内的物种，目前成为病原真菌快速鉴定手段。2纳米孔测序技术植物病原微生物的传统检疫方法，如形态学鉴定、免疫学检测、分子生物学等，需要事先了解病原物的生物学、血清学、基因组等特性，而在实际工作中，检测到的很多都是未知病原物或者病原物难以分离培养，传统植物病原微生物的检疫方法灵敏度较低、效率较低、耗时较长，在这些情况下难以应用。目前，宏基因组测序已广泛地应用于植物病原的检测和鉴定，其中以第二代测序技术（N e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g,N G S）为代表。S a n g e r 测序技术一次只能对 1条 D N A片段进行测序，N G S 技术可以一次对几十万到几百万条 D N A分子进行序列测定，不需要分离病原物，就可实现对植物病害的初步诊断。但是在植物病原快速检测领域，N G S 技术也存在不足之处。第一，N G S 技术的每条序列读长的长度在 3 5 7 0 0 b p，序列读长比较低；第二，N G S 样品的制备耗费时间多，从制备文库到数据分析完成，测序周期很长，可能要花 1 6 d 的时间；第三，N G S 测序需要的设备重且成本很高，对专业技术人员的要求也比较高。N G S 这些缺点限制了植物病原的快速检测和现场检测的推广应用。O N T 牛津纳米孔技术公司研究的纳米孔测序技术与已有的测序技术不同，它是目前唯一可以直接对核酸分子进行测序的技术，不涉及 D N A合成，这在很大程度上弥补了 N G S 测序技术的不足。7878农学经济相比于其他病原微生物的检测方法，纳米孔测序技术具有高效、全面、快速地分析复杂的核苷酸群体功能。从待测样品中提取 D N A或 R N A，构建简单的文库，在计算机上进行检测，就可以得到样品中病原微生物的全部信息，与其他方法相比，可以缩短研究周期，简化研究步骤，检测出更多的基因和未知序列。C h a l u p o w i c z 等采用纳米孔测序对番茄上的细菌、病毒、真菌、植原体等作物病原进行测序，在 1 2 h 内就可以鉴定出所有接种的病原体。E d w a r d s 等从 2 0 种细菌中，获得等摩尔量的 1 6 S r D N A，通过建立细菌群落模型，纳米孔测序技术可以快速鉴定出上述 2 0 种细菌，菌种和菌属水平的鉴定准确率为 9 1 和9 7。F e l l e r s 等对来自受感染小麦组织的 C D N A用单链牛津纳米孔测序技术（O N T）进行测序，检测到小麦条纹花叶病毒（WS M V）和大麦黄矮病毒（B Y D V），结果表明O N T 可以更准确地识别致病病毒病原体，并且具有足够的分辨率来提供因果变异的证据。M i c h e l e 等以纳米孔测序检测马铃薯四种病毒（P V Y、P V X、P V S、P L R V）和五种P V Y基因型的全基因组序列，这表明 O N T 技术可以用来研究高度变异病毒的遗传多样性。3应用前景进境玉米可能携带大量有害生物，在中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录（2 0 2 1 年 4 月 9 日更新）中，涉及玉米病害的包括真菌 1 4 种、细菌 6 种、病毒 3 种。近年来，口岸检疫部门从进境玉米中截获玉米褪绿斑驳病毒、玉米矮花叶病毒、小麦线条花叶病毒、玉米内州萎蔫病菌等检疫性病害，以及尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、玉米黑粉菌等 3 0 多种常见病害。目前，分子检测技术是进境玉米病害检测的重要手段。大多数玉米病原菌的分子诊断技术仅限于检测已知的目标病原菌，而实际上进境玉米上可能同时携带多种类型病原菌。因此在对携带的病原菌的形态特征、生理生化性状等全都未知的情况下，快速准确地鉴定出有害生物将是分子检测技术发展的重点方向。纳米孔测序技术在植物病原快速检测领域具有明显的优势，植物病原菌的现场快速检测是口岸植物检疫的前提。随着分子检测技术的发展和应用，植物病原的诊断效率将大大提高，宏基因组测序技术为植物病害数据库的完善提供了更多可能。随着植物病害全球化进程加速，宏基因组测序技术将进一步满足人们对准确、快速、现场诊断的植物检疫方法的迫切需求。参考文献：1 黄国明，罗加凤，廖芳，等.多年生黑麦草中小麦矮腥黑穗病菌 PCR 检测方法的建立 J.植物检疫，2008（03）：144-147.2 张卫东，权永兵，廖力，等.RT-PCR 法特异性快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒 J.江西农业大学学报，2011，33（01）：43-46+83.3 刘洪义，刘忠梅，张金兰，等.进境玉米种子中玉米褪绿斑驳病毒的检测鉴定 J.东北农业大学学报，2011，42（10）：36-40.4 沈建国，郑荔，王念武，等.福建口岸首次截获玉米褪绿斑驳病毒和玉米矮花叶病毒 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