淫羊藿苷调控mTOR_Akt_CREB通路对高糖诱导的足细胞自噬及凋亡的影响.pdf

谢指标及肝脏病变的影响.中国病理生理杂志():.龙伟清彭永健何晓敏等.青钱柳叶提取物对 型糖尿病模型大鼠的治疗作用.中药材():.():.!.:.:/.:.淫羊藿苷调控/通路对高糖诱导的足细胞自噬及凋亡的影响李明霞杨谦乔海霞王晓玲贾丽媛胡利梅任卫东(.河北北方学院附属第一医院内分泌科张家口.河北北方学院张家口)摘 要 目的 探讨淫羊藿苷对高糖诱导的足细胞自噬、凋亡及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶()/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白()通路的影响 方法 将小鼠足细胞 分为 组:正常对照组(.葡萄糖)、高糖组(葡萄糖)、淫羊藿苷组(葡萄糖 淫羊藿苷)、组(葡萄糖 )、淫羊藿苷 组(葡萄糖 淫羊藿苷)培养 后噻唑蓝法检测 细胞活力吖啶橙染色观察 细胞自噬情况流式细胞术检测 细胞凋亡蛋白印迹法检测 细胞自噬微管相关蛋白 轻链()、自噬相关蛋白()、凋亡 相关 蛋白()、淋巴细胞瘤()和/通路相关蛋白的表达 结果 与正常对照组比较高糖组 细胞活力、磷酸化()/、磷酸化()/、磷酸化()/蛋白表达水平显著降低(.)自噬能力增强自噬体表现出橙色荧光细胞凋亡率、/、蛋白表达水平显著升高(.)与高糖组比较淫羊藿苷组 细胞活力、/、/、/、/蛋白表达水平显著升高自噬能力进一步增强自噬体数量增多自噬体呈现出砖红色荧光(.)细胞凋亡率、蛋白表达水平显著降低(.)组 细胞活力、/、/、/、/蛋白表达水平显著降低自噬能力减弱自噬体数量减少自噬体表现出橙色荧光(.)细胞凋亡率、蛋白表达水平显著升高(.)淫羊藿苷 可逆转淫羊藿苷对高糖诱导 细胞的作用效果(.)结论淫羊藿苷通过激活/通路促进高糖诱导的足细胞自噬抑制细胞凋亡关键词 淫羊藿苷哺乳动物雷帕霉素靶蛋白蛋白激酶 环磷酸腺苷反应元件结合蛋白高糖足细胞自噬凋亡中图分类号.文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()/(.)()/()/().:(.)()()()().医药导报 年 月第 卷第 期 ()()()()/.()/()/()/(.)/(.)./(.)(.)/(.)(.)(.)./.糖尿病肾病()是糖尿病患者常见的微血管并发症之一其特点是一系列异常病理改变包括肾小球肥大、系膜增生、肾小球基底膜增厚和细胞外基质积聚 足细胞是肾小球毛细血管过滤的重要组成部分之一越来越多的证据表明由足细胞的异常凋亡与自噬受阻引起的细胞损伤与 的发生和进展有关 因此研究足细胞的损伤对于揭示 的发生和发展具有重要的指导意义 淫羊藿苷是淫羊藿提取物属黄酮类化合物可用于治疗肾病 淫羊藿苷可通过减轻大鼠炎症反应、氧化应激水平减少细胞外基质的增生并抑制肾组织细胞的凋亡来发挥对 大鼠肾功能的保护作用哺乳动物雷帕 霉 素 靶 蛋 白()/丝 氨 酸 苏 氨 酸 蛋 白 激 酶()/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白()通路的激活可抑制细胞凋亡、促进自噬从而发挥对粘菌素诱导的神经毒性的拮抗作用 但淫羊藿苷能否通过调控/通路来影响足细胞损伤介导的 发生尚不可知因此收稿日期 修回日期 基金项 目 河 北 省 医 学 科 学 研 究 课 题 计 划 项 目()作者简介 李明霞()女河北张家口人副主任医师学士研究方向:内分泌与代谢病:电话:.通信作者 任卫东()男河北张家口人主任医师硕士研究方向:内分泌与代谢病:电话:.本研究通过构建高糖诱导足细胞损伤模型以探讨淫羊藿苷对高糖状态下足细胞自噬、凋亡的影响及其作用机制 材料与方法.细胞来源小鼠足细胞 购自上海酶研生物科技有限公司批号:.主要药物、试剂与仪器 淫羊藿苷购自北京百灵威科技有限公司(原料药含量货号:)抑制剂购自上海金穗生物科技有限公司(货号:)胎牛血清(货号)、培养基(货号:)、噻唑蓝(货号:)、二喹啉甲酸()试剂盒(货号:)均购自郑州金图生物科技有限公司吖啶橙(货号:)、细胞凋亡检测试剂盒(货 号:)、电 化 学 发 光()试 剂 盒(货 号:)均购自碧云天生物科技有限公司兔抗鼠微管相关蛋白 轻链()(货号:)、(货号:)、自噬相关蛋白(货号:)、淋巴细胞瘤()相关 蛋白()(货号:)、(货号:)、磷酸化(货号:)、磷酸化(货号:)、磷酸化(货号:)、(货号:)、(货号:)、(货号:)、(货号:)一抗羊抗兔二抗(货号:)均购自美国 公司酶标仪(型号:)、凝胶成像仪(型号:)均购自上海书俊仪器设备有限公司荧光显微镜(型号:)、流式细胞仪(型号:)均购自上海益鸣生物技术有限公司.细胞培养与分组将 细胞置于含有、重组小鼠干扰素()的 培养基中在 、二氧化碳()和相对湿度 下进行常规传代培养 为了刺激细胞分化将传代后的 细胞在含有 且不含小鼠 的 培养基中在 、下培养 使其分化成熟并达到 的融合用于后续实验依据参考文献设计浓度将 细胞分为 组:正常 对 照 组(.葡 萄 糖)、高 糖 组(葡萄糖)、淫羊藿苷组(葡萄 糖 淫 羊 藿 苷)、组(葡萄糖)、淫羊 藿 苷 组(葡 萄 糖 淫羊藿苷)各组按上述浓度要求向 培养基中添加相应试剂或者药物培养 后用于后续实验 每组设置 个复孔.法检测 细胞活力将 细胞以每孔个接种到 孔板中按照“.节”中的分组分别处理 后将 溶液 添加到每个孔中并在 下再孵育 使用酶标仪检测 波长处的吸光度()计算细胞活力(细胞活力各处理组/正常对照组).吖啶橙染色观察 细胞的自噬情况收集“.节”中处理 的 组 细胞取等量各组 细胞分别转移至含 吖啶橙的无血清 培养基中培养 收集细胞用磷酸盐缓冲液()洗 次利用荧光显微镜观察各组 细胞的自噬情况.流式细胞术检测 细胞凋亡收集上述“.节”中处理 的 组 细胞按照每孔 个的浓度接种到 孔培养板中用预冷 洗涤细胞 后将细胞重悬于 结合缓冲液中然后向每孔中加入 和碘化丙啶各 室温下避光孵育 利用流式细胞术分析 细胞凋亡情况.蛋白印迹法检测 细胞自噬(、)及凋亡(、)和/通路相关蛋白的表达 将 组 细胞用 洗涤 次后在含有蛋白酶抑制剂混合物的 裂解缓冲液中裂解裂解物以 ()、离心 收集上清液 试剂盒用于测量蛋白质浓度通过凝胶电泳分离等量的蛋白质后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上将膜用 脱脂牛奶室温封闭 后分 别 加 入 一 抗 抗 体()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、()下孵育过夜次日用 洗涤 次然后与羊抗兔二抗()在室温下孵育 通过 化学发光试剂盒对蛋白条带的显色情况进行检测以 软件对蛋白质的表达进行定量.统计学方法 采用 .版软件进行统计分析计量数据经检验均符合正态分布用均数标准差()表示单因素方差分析用于多组之间的比较进一步两组间比较采用 检验以.为差异有统计学意义 结果.组 细胞活力比较与正常对照组比较高糖组 细胞活力显著降低(.)与高糖组比较淫羊藿苷组 细胞活力显著升高(.)组 细胞活力显著降低(.)与淫羊藿苷组比较 组、淫羊藿苷 组 细胞活力显著降低(.)与 组比较淫羊藿苷 组 细胞活力显著升高(.)见表 表 组 细胞活力比较.组别细胞活力正常对照组.高糖组.淫羊藿苷组.组.淫羊藿苷 组.与正常对照组比较.与高糖组比较.与淫羊藿苷组比较.与 组比较.组 细胞吖啶橙染色比较正常对照组 细胞自噬体呈现出正常的亮绿色荧光与正常医药导报 年 月第 卷第 期对照组比较高糖组 细胞自噬能力增强自噬体表现出橙色荧光与高糖组比较淫羊藿苷组 细胞自噬能力进一步增强自噬体数量增多自噬体呈现出砖红色荧光 组 细胞自噬能力减弱自噬体数量减少自噬体表现出橙色荧光与淫羊藿苷组比较 组、淫羊藿苷 组 细胞自噬能力减弱自噬体数量减少自噬体表现出橙色荧光与 组比较淫羊藿苷 组 细胞自噬能力增强自噬体表现出橙色荧光 见图.组 细胞凋亡率比较与正常对照组比较高糖组 细胞凋亡率显著升高(.)与高糖组比较淫羊藿苷组 细胞凋亡率显著降低(.)组 细胞凋亡率显著升高(.)与淫羊藿苷组比较 组、淫羊藿苷 组 细胞凋亡率显著升高(.、.)与 组比较淫羊藿苷 组 细胞凋亡率显著降低(.)见表、图.组 细胞自噬(、)、凋亡(、)相关蛋白表达比较与正常对照组比较高糖组 细胞/、蛋白表达水平显著升高 蛋白表达水平显著降低(.)与高糖组比较淫羊藿苷组 细胞/、蛋白表达水平显著升高 蛋白的表达水平显著降低(.)组 细胞 表 组 细胞凋亡率比较.组别细胞凋亡率正常对照组.高糖组.淫羊藿苷组.组.淫羊藿苷 组.与正常对照组比较.与高糖组比较.与淫羊藿苷组比较.与 组比较./、蛋白表达水平显著降低蛋白表达水平显著升高(.)与淫羊藿苷组比较 组、淫羊藿苷 组 细胞/、蛋白表达水平显著降低 蛋白表达水平显著升高(.)与 组比较淫羊藿苷 组 细胞/、蛋白表达水平显著升高 蛋白表达水平显著降低(.)见图 和表.组 细胞/通路相关蛋白表达比较与正常对照组比较高糖组细胞/、/、/蛋白的表达水平显著降低(.)与高糖组图 吖啶橙染色检测 细胞自噬().()图 流式细胞术检测 细胞凋亡.正常对照组.高糖组.淫羊藿苷组.组.淫羊藿苷 组图 组 细胞、蛋白印迹图.比较淫羊藿苷组 细胞/、/、/蛋 白 表 达 水 平 显 著 升 高(.)组 细胞/、/、/蛋白表达水平显著降低(.)与淫羊藿苷组比较 组、淫羊藿苷 组 细胞/、/、/蛋白表达水平显著降低(.)与 组比较淫羊藿苷 组 细胞/、/、/蛋白表达水平显著升高(.)见表 和图 讨论 的临床特征表现为持续性蛋白尿升高、肾小球基底膜增厚和细胞外基质聚集导致自噬流抑制、足细胞损伤进而促进肾功能障碍 然而足细胞损伤介导的 的发病机制仍不清楚并且缺乏 的治疗策略 研究表明足细胞自噬主要负责蛋白质和细胞器降解调节细胞稳态其功能障碍是足细胞损伤的重要诱导因素短时间内的高糖处理可诱导足细胞自噬而随着葡萄糖干预时间的延长自噬水平降低 中足细胞的增殖和再生是有限的其异常凋亡与 的发生和进展有关 本研究结果显示与正常对照组比较高糖组 细胞活力降低自噬体数量增加细胞凋亡率升高自噬相关蛋白/、及促凋亡蛋白 表达水平升高抗凋亡蛋白 表达水平降低提示高糖组 细胞自噬及凋亡能力增强表明高糖诱导的足细胞损伤模型构建成功淫羊藿苷具有保护神经元免受损伤、改善骨质疏松、抗炎、抗肿瘤、抗抑郁、抗氧化等多种生物活性张颖等发现淫羊藿苷能改善 大鼠肾动脉舒缩功能 等报道淫羊藿苷可减轻高糖诱导的 大鼠和肾小球系膜细胞的氧化应激抑制细胞外基质的产生等报道淫羊藿苷通过抑制细胞凋亡和激活自噬来预防骨关节炎的发生 但淫羊藿苷对高糖医药导报 年 月第 卷第 期表 组 细胞/、蛋白表达水平比较./组别/正常对照组.高糖组.淫羊藿苷组.组.淫羊藿苷 组.与正常对照组比较.与高糖组比较.与淫羊藿苷组比较.与 组比较.表 组 细胞/、/、/蛋白表达水平比较./组别/正常对照组.高糖组.淫羊藿苷组.组.淫羊藿苷 组.与正常对照组比较.与高糖组比较.与淫羊藿苷组比较.与 组比较.正常对照组.高糖组.淫羊藿苷组.组.淫羊藿苷 组图 组 细胞、蛋白印迹图.诱导的 细胞自噬及凋亡的影响笔者尚未见报道 本研究结果显示与高糖组比较淫羊藿苷组 细胞活力升高自噬体数量增加细胞凋亡率降低自噬相关蛋白/、及抗凋亡蛋白 表达水平升高促凋亡蛋白 表达水平降低提示淫羊藿苷可促进高糖诱导的 细胞自噬并抑制细胞凋亡减轻细胞损伤 信号通路是一条经典的调控自噬凋亡信号通路在细胞代谢中发挥重要作用 研究表明 在多条信号通路中位于核心位置其可通过激活下 游/通 路 发 挥 神 经 保 护 作 用 等研究表明激活/通路可防止高糖诱导的神经毒性 等研究显示激活/通路可防止氧化低密度脂蛋白诱导的人内皮细胞氧化损伤 本研究结果显示高糖组 细胞/、/、/蛋白表达水平均低于正常对照组表明/通路在高糖条件下处于抑制状态 而淫羊藿苷组 细胞中/、/、/蛋白表达水平显著高于高糖组推测淫羊藿苷可能通过激活 /通路促进高糖诱导的足细胞自噬及抑制细胞凋亡 为了验证该推测本研究设置/通路抑制剂 进行干预结果显示与高糖组和淫羊藿苷组比较 组 细胞活力降低自噬体数量减少细胞凋亡率升高促凋亡蛋白 表达水平升高自噬相关蛋白/、及抗凋亡蛋白 表达水平降低表明 抑制/通路后可加重高糖诱导的 细胞损伤 而淫羊藿苷 可逆转淫羊藿苷对高糖诱导 细胞的作用效果进一步证明了淫羊藿苷通过激活/通路促进高糖诱导的 细胞自噬抑制细胞凋亡进而减轻细胞损伤综上所述淫羊藿苷可促进高糖诱导的 细胞自噬抑制细胞凋亡该机制与激活/通路有关 但关于淫羊藿苷调控高糖诱导的 细胞自噬及凋亡的作用机制较多有待进一步研究参考文献 刘琪文杨德智杨秀颖等.大黄酸对糖尿病肾病的作用及其机制研究进展.医药导报():.:.():./.():.赵锦陈玮魏杰等.淫羊藿苷对糖尿病肾病大鼠肾功能的保护作用及相关机制.免疫学杂志():./.():.杨晶晶沈宗姮何沛原等.小檗碱通过下调 缓解高糖诱导的足细胞损伤研究.中草药():.吴艺璇彭维艳刘露等.淫羊藿苷通过 减轻脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞线粒体损伤.中国病理生理杂志():.彭青温彦静李茜等./通路在高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞/凋亡中的作用机制探讨.天津医药():.金晟余建峰张继波等.基于多学科管理雷公藤多苷联合替米沙坦治疗糖尿病肾病 期对患者尿蛋白和炎症的影响.医药导报():.:././.():.():.():.:./.李聪聪赵鹏秦燕勤等.淫羊藿苷的药理活性研究进展.中医学报():.张颖李赛丁选胜.淫羊藿苷对糖尿病肾病大鼠肾动脉舒缩功能的影响.药学与临床研究():.():.():.孙阳孙悦顾媛媛等.信号通路在细胞自噬和凋亡调节中的作用.中国医学装备():.王珍杨洛廖敏等.信号通路在糖尿病肾病发病机制中的研究进展.生物技术进展():./.():.():.医药导报 年 月第 卷第 期