结直肠癌组织Tregs占比和Foxp3、IL-10、TGF-β_%281%29mRNA表达变化及其意义.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 24 期结直肠癌组织Tregs占比和Foxp3、IL-10、TGF-1 mRNA表达变化及其意义马虎林1，孙晓霞2，陈良全1，张浩1，党利敏31 内蒙古自治区人民医院腹部肿瘤外科，呼和浩特 010010；2 内蒙古自治区人民医院外科门诊；3 内蒙古医科大学内蒙古临床学院摘要：目的观察结直肠癌（CRC）组织中调节性T细胞（Tregs）占比及叉头转录因子（Foxp3）、白细胞介素10（IL-10）、转化生长因子1（TGF-1）表达情况，并分析Tregs占比与CRC临床病理参数的关系。方法选取手术切除的CRC组织及正常结肠组织各24例份，采用流式细胞术测算两组织中Tregs占比，实时定量PCR法检测两组织中Foxp3、IL-10、TGF-1 mRNA相对表达量，Spearman相关分析法分析Tregs占比与CRC临床病理参数的关系。结果与正常结肠组织比较，CRC 组织 Tregs 占比增加（P0.05）；与正常结肠组织比较，CRC 组织 Foxp3、IL-10、TGF-1 mRNA相对表达量增加（P均0.05）；Tregs占比与CRC肿瘤分期相关（P0.05）。结论CRC组织中Tregs占比增加，Foxp3、IL-10、TGF-1表达升高，Tregs占比与患者肿瘤分期有关，Tregs可能通过调节Foxp3、IL-10、TGF-1发挥免疫逃逸作用。关键词：结直肠癌；调节性T细胞；叉头状转录因子；白细胞介素10；转化生长因子1doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.24.004 中图分类号：R735.3 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）24-0017-04Proportion of Tregs in colorectal cancer and expression changes of Foxp3，IL-10 and TGF-1 mRNA and their significanceMA Hulin1，SUN Xiaoxia，CHEN Liangquan，ZHANG Hao，DANG Limin1 Abdominal Tumor Surgery Department，Inner Mongolia Peoples Hospital，Hohhot 010010，ChinaAbstract：Objective To explore the proportion of regulatory T cells（Tregs）in colorectal cancer（CRC）tissues and the expression of Foxp3，interleukin 10（IL-10），and transforming growth factor 1（TGF-1），and to analyze the relationships between the proportion of Tregs and the clinicopathological parameters of CRC.Methods Twenty-four CRC tissues and 24 normal colon tissues were selected from surgical resection.Flow cytometry was used to detect the proportion of Tregs，and real-time quantitative PCR was used to detect the expression levels of Foxp3，IL-10 and TGF-1 mRNA in these two groups.Spearman correlation analysis was used to analyze the relationships between the proportion of Tregs and the clinicopathological parameters of CRC.Results Compared with the normal colon tissues，the proportion of Tregs in CRC tissues increased（P0.05）.Compared with the normal colon tissues，the relative expression of Foxp3，IL-10 and TGF-1 mRNA in CRC tissue increased（all P0.05）.Tregs proportion was correlated with the stage of CRC（P0.05）.Conclusions The proportion of Tregs in CRC tissues increased，and the expression of Foxp3，IL-10 and TGF-1 increased.The proportion of Tregs was related to the tumor stage of patients，and Tregs played an immune escape role probably by regulating Foxp3，IL-10 and TGF-1.Key words：colorectal carcinoma；regulatory T cells；Foxp3；interleukin-10；transforming growth factor-1结直肠癌（CRC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一1。CRC 在早期大多无明显临床症状，肿瘤确诊率较低，多数患者确诊时已属中晚期。CRC的发生发展及免疫逃逸机理仍不明确，对于丧失手术时机的CRC 患者仍缺乏有效的治疗方法。调节性 T 细胞（Tregs）是机体内重要的免疫抑制细胞，可抑制CD8+CTL细胞、自然杀伤细胞及树突状细胞（DC）等基金项目：内蒙古自治区人民医院院内基金（2021YN23）；内蒙古自治区“草原英才”工程青年创新人才基金（Q2022170）。第一作者简介：马虎林（1983-），男，博士，副主任医师，主要研究方向为腹部恶性肿瘤的基础及临床研究。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）17山东医药2023 年第 63 卷第 24 期多种免疫效应细胞的功能，在肿瘤免疫逃逸机制中具有关键作用。Tregs通常是指 CD4+CD25+Foxp3+T细胞，是继 K-ras后对 CRC预后判断具有潜在意义的分子标记物之一，可能成为一项CRC的独立预后评估指标2。白细胞介素 10（IL-10）和转化生长因子1（TGF-1）是参与免疫调节及具有免疫抑制功能的细胞因子，而Treg细胞可通过释放IL-10和TGF-等抑制性细胞因子参与维持对机体免疫平衡3-4。叉头转录因子（Foxp3）是Tregs最关键的细胞内标志物，对于Tregs的分化和功能维持具有重要作用。大量研究5-7证实，外周循环、区域淋巴结和恶性肿瘤患者肿瘤部位（包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌和皮肤癌）的 Tregs 均会增加。CRC 患者正常结肠黏膜中Foxp3+Treg密度高与预后较差相关8-10。因此，探讨Tregs在 CRC中的可能作用，在 CRC的靶向治疗中具有重要意义。本研究观察了CRC组织中调节性T细胞（Tregs）占比及 Foxp3、IL-10、TGF-1 mRNA 表达情况，分析了 Tregs占比与 CRC临床病理参数的关系，旨在探讨Tregs发挥免疫逃逸的可能机制，为CRC的治疗提供一个新的思路。1 资料与方法 1.1临床资料选取2021年6月2022年6月内蒙古自治区人民医院收治的 CRC患者 24例，男 16例，女 8 例；年龄60 岁 10 例，60 岁 14 例；TNM 分期：期3例，期6例，期11例，期4例；回盲部肿瘤1例，升结肠肿瘤4例，横结肠肿瘤3例，降结肠肿瘤5例，乙状结肠肿瘤11例；肿瘤直径：5 cm 13例，5 cm 11例；组织学分级：中高分化17例，低分化7例。所有患者术前均经病理学检查确诊，且均未行化疗或放疗。选取手术切除的CRC组织及正常结肠组织各24例份。本研究经内蒙古自治区人民医院伦理委员会批准，并获得所有患者的书面知情同意。1.2主要试剂及仪器MACS CD4 MicroBeads、MACS 分选器、MACS-Octo 解离器均购自于德国Miltenyi Biotec 公司；TRIzol 液购自于 Invitrogen 公司；RNA提取试剂盒购自于德国Qiagen公司；Superscript 逆转录试剂盒购自于Miltenyi公司；FITC标记鼠抗人CD4单克隆抗体、PE标记鼠抗人CD25单克隆抗体、PE标记鼠抗人 FOXP3单克隆抗体购自于Pharmingen公司；胎牛血清、RPMI 1640培养基购自于美国Gibco公司；FASC Calibur流式细胞仪购自于美国 BD公司；荧光定量 PCR仪购自于美国 Corbett公司。1.3CRC 组织中 Tregs 占比测算单核细胞分离：将CRC组织和正常结肠组织样本切碎，并研磨为悬糊状，在含2.5%胎牛血清（FBS）和1 mmol/L二硫苏糖醇的汉克斯缓冲盐水溶液（HBSS）中孵育20 min，然后在 37、0.75 mmol/L EDTA 中孵育 3周期，每次15 min，分别去除粘液和上皮细胞。将样品转移到含有钙和镁的gentle MACS C管（Miltenyi）中，加 入 0.5 mg/mL 胶 原 酶（Sigma 公 司）、50 ng/mL DNAse （Thermo Fisher）、2%胎牛血清和10%胎牛血清。拧紧C管盖子，倒置在带加热器的gentle-MACS Octo解离器（Miltenyi）上进行组织解离。用滤器去除分离的组织块，并用HBSS液冲洗滤器，收集过滤液，室温下以300 g离心10 min，弃去上清，用冰HBSS重悬细胞。CD4+T细胞分选：采用免疫磁珠法。在重悬的单核细胞中加入PBS洗涤一次，以1 500 r/min速度离心5 min，弃去上清；取约1107细胞加入80 L缓冲液重悬细胞，加入20 L的 MACS CD4+MicroBeads，混匀，4 条件下放置20 min；转移至15 mL离心管中，加入4 mL的PBS缓冲液，充分混匀，以1 500 r/min速度离心时间5 min；弃离心上清，用500 L的PBS 缓冲液重悬细胞，使用吸管缓慢反复吹打10次，使细胞能够均匀分散开同时磁珠不脱离细胞；将分离柱置于MACS分选器中，加入3 mL的PBS缓冲液冲洗分离柱，然后将细胞悬液缓慢加入到分离柱中，进行分选；将分离柱移出磁场，用5 mL的PBS缓冲液反复冲洗分离柱，收集冲洗液，微量离心机离心5 min（2 500 r/min），弃上清溶液，并用 500 L 的 PBS 缓冲液重悬所有细胞，-70 冻存备用。此部分即为CD4+T细胞。Tregs占比测算：取CD4+T细胞，计数，调整细胞悬液浓度为 1107/mL，取样 100 L 加入离心管，封口，4 孵育 20 min；分别加入 10 L 的 CD25、10 L 的CD4和10 L的Foxp3抗体，涡旋振荡45 s，充分混匀，封口，4 低温避光孵育15 min；加新配制的溶血素2 mL（按1 9的比例配置溶血素，1 mL的10溶血素+9 mL的双蒸水）后避光孵育 1015 min，根据红细胞裂解状态，以1 500 r/min速度离心5 min；弃去上清，用 PBS 缓冲液洗涤 1 次，再加入 200500 L的PBS液混匀，封口，避光4 保存，上流式细胞仪检测。对照管按同样测定条件上机检测。结果分析用Flow Jo软件。根据散点图分布选定淋巴细胞群，再以CD4+T细胞和SSC设门，选择CD4+T细胞分析门内相关Tregs的比例。Tregs占比以CD4+T细胞中被标记为CD4+CD25+Foxp3+的细胞所占百分比表示。1.4CRC组织中Tregs相关因子检测采用实时定18山东医药2023 年第 63 卷第 24 期量PCR法。取CRC组织和正常结肠组织，液氮冷冻后研磨成粉，TRIzol提取组织总RNA，用SuperScript 逆转录试剂盒合成cDNA，按照PCR试剂盒说明书进行扩增，引物设计及合成由 TAKRA 公司完成，Foxp3 上游引物 5-GAGAAGCTGAGTGCCATGCA-3，下游引物5-AGAGCCCTTGTCGGATGAT-3；IL-10上游引物 5-CGAGATGCCTTCAGCAGAGTG-3，下 游 引 物 5-TCATCTCAGAACAAGGCTTGGC-3；TGF-1上游引物 5-GGCAGTGGTTGAGCCGTGGA-3，下游引物5-TGTTGGACAGCTGCTCCACCT-3；GAPDH 上 游 引 物 5-AAGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3，下游引物5-ATGGCCCAGCGGATGAG-3。反应条件：95 预变性2 min，95 变性15 s，60 退火30 s，72 延伸15 s，共45个循环。以GAPDH为内参，采用 2Ct法计算 Foxp3、IL-10、TGF-1 mRNA的相对表达量。1.5统计学方法采用SPSS25.0统计软件。符合正态分布的计量资料以-x s表示，组间比较采用配对t检验；计数资料比较采用2检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1CRC 组 织 和 正 常 结 肠 组 织 Tregs 占 比 比较CRC 组织和正常结肠组织 Tregs 占比分别为4.23%0.74%、7.73%2.04%，两 者 比 较，P0.05。2.2CRC组织和正常结肠组织Foxp3、IL-10、TGF-1相对表达量比较CRC组织和正常结肠组织Foxp3相对表达量分别为4.05 1.27、1.35 0.53，IL-10相对表达量分别为3.52 0.98、1.4 0.31，TGF-1相对表达量分别为 0.96 0.24、0.78 0.25，两者比较，P均0.05。2.3Tregs占比与CRC临床病理参数的关系Tregs占比与 CRC临床病理参数的关系见表 1，由表 1可知，Tregs占比与CRC肿瘤分期相关（P0.05）3 讨论 CRC是世界上最常见的致命恶性肿瘤之一，全球每年有1 000多万人罹患结、直肠癌11。在世界范围内，我国CRC的发病率低于西方发达国家，但目前总体呈上升趋势。我国CRC发病率已升至恶性肿瘤的第三位，在一些发达城市病死率甚至已升至第二位12-13。目前CRC的治疗方法以多种治疗手段联合的综合治疗模式为主，虽然为患者带来了一定的生存获益，但5年生存率仍徘徊在50%60%，总体治疗效果不尽如人意14。因此，寻找理想的CRC早期诊断和预后评价指标以及理想的治疗靶点十分必要。Tregs是一种具有免疫抑制性的 T淋巴细胞亚群，被认为是参与肿瘤免疫耐受的主要细胞群。在肿瘤免疫逃逸过程中，Tregs通过细胞间的直接接触和分泌细胞因子（如TGF-1、IL-10等）的方式，抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞、DC和NK细胞的功能活性，从而降低机体免疫应答的效力，达到免疫抑制的作用，使肿瘤细胞发生免疫逃逸15。研究16-17表明，Foxp3是Tregs中的特异性标志物，其表达水平对于Tregs的成熟发育和免疫抑制作用的发挥具有重要意义。Foxp3作为转录因子，可通过调节多种与肿瘤发生具有直接或者间接关系的肿瘤基因表达来发挥对肿瘤的免疫抑制作用，如Foxp3可抑制LAST2、p21、BRCA等常见的抑癌基因的表达。Foxp3也可通过激活Wnt/-catenin信号通路和上皮间质细胞转化（EMT）促使肿瘤生长18。IL-10主要通过抑制抗原提呈细胞（APCs）对抗原的递呈从而抑制机体对肿瘤免疫监视作用。如抑制DC、Th17细胞的活性，减少IL-23、IL-17的分泌，进而促进肿瘤的发生发展19。TGF-1不仅能刺激血管生成和免疫逃避，而且可通过刺激癌细胞的EMT过程，进而促进肿瘤生长。此外，TGF-1还可通过对癌基因的激活或肿瘤抑制因子丢失而减轻免疫系统对肿瘤细胞的表1Tregs占比与CRC临床病理参数的关系（-x s）临床病理参数性别 男 女年龄 60岁 60岁肿瘤部位 回盲部 升结肠 横结肠 降结肠 乙状结肠肿瘤分期 期 期肿瘤直径 5 cm 5 cm组织学分级 中高分化 低分化n16 81014 1 4 3 511 519131117 7Tregs占比7.39%1.87%6.98%0.87%7.21%1.28%6.93%2.23%7.20%0.00%6.67%0.85%7.16%0.75%6.82%1.02%6.91%0.77%5.81%0.38%7.05%0.88%6.68%1.24%7.07%1.62%6.75%0.92%6.60%1.04%19山东医药2023 年第 63 卷第 24 期抑制作用。如 TGF-1通过介导 PSPC1等因子的表达，从而促进肿瘤进展20。Tregs在CRC、肝癌、卵巢癌及前列腺癌等多种肿瘤患者外周血和肿瘤局部微环境中表达增高，且Tregs水平与患者肿瘤进展及预后呈负相关；在肿瘤切除后 Tregs可恢复到正常水平，而肿瘤复发时Tregs增多，而且这些Tregs表达的Foxp3水平也较高，说明Tregs与肿瘤的侵袭性和预后密切相关21。对于CRC患者，外周血、肿瘤引流区域淋巴结、肿瘤部位Tregs会增多，这些Tregs可以主动迁移到免疫活性部位5，22。研究11发现，CRC组织与正常CRC组织相比FOXP3过表达，FOXP3的表达与Dukes分期及淋巴结转移呈正相关。因此，Tregs和Foxp3在CRC的发生、发展和治疗中具有重要的作用，可能成为治疗靶点和预后评估的指标。本研究显示，相比正常结肠组织，肿瘤浸润组织中Tregs明显增多，且与肿瘤的TNM分期呈正相关，同时肿瘤组织中 Foxp3、IL-10、TGF-1 mRNA 表达升高，这与之前的许多研究结果一致，证实Foxp3+通过基因转录水平下调促炎性因子的表达，如TNF-p、IL-2、GM-CSF 等，并上调免疫抑制因子的表达，如IL-10、TGF-1以及血红素加氧酶等，从而发挥免疫抑制的功能。这些研究表明，Foxp3具有特异性地表达 Tregs 的作用，因此 Foxp3 可作为 Tregs 的一个特异性标志物。从另一个角度来看，我们可以利用检测 Foxp3的水平来评估 Tregs在实验标本中的表达水平，进而评估其免疫抑制功能的强弱。总之，CRC组织中Tregs占比增加，Tregs占比与患者肿瘤分期有关，Foxp3、IL-10、TGF-1在CRC组织中呈高表达。参考文献：1ZHUO C，XU Y，YING M，et al.FOXP3+Tregs：heterogeneous phenotypes and conflicting impacts on survival outcomes in patients with colorectal cancer J.Immunol Res，2015，61（3）：338-347.2陈丽芳，余英豪.结直肠癌潜在预后标志物的研究进展 J.世界华人消化杂志，2012，20（25）：2377-2381.3WU X K，STENER-VICTORIN E，KUANG H Y，et al.Effect of acupuncture and clomiphene in chinese women with polycystic ovary syndrome：a 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